Un pequeño ARN de Pseudomonas aeruginosa regula la infección crónica y aguda

Nature volumen 618, páginas 358–364 (2023)Cite este artículo

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La capacidad de cambiar entre diferentes estilos de vida permite que las bacterias patógenas prosperen en diversos nichos ecológicos1,2. Sin embargo, falta una comprensión molecular de los cambios en el estilo de vida del huésped humano. Aquí, al examinar directamente la expresión de genes bacterianos en muestras de origen humano, descubrimos un gen que orquesta la transición entre la infección crónica y aguda en el patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa. El nivel de expresión de este gen, denominado aquí sicX, es el más alto de los genes de P. aeruginosa expresados ​​en infecciones de heridas crónicas humanas y fibrosis quística, pero se expresa en niveles extremadamente bajos durante el crecimiento estándar de laboratorio. Mostramos que sicX codifica un pequeño ARN que es fuertemente inducido por condiciones de bajo oxígeno y regula postranscripcionalmente la biosíntesis anaeróbica de ubiquinona. La eliminación de sicX hace que P. aeruginosa cambie de un estilo de vida crónico a uno agudo en múltiples modelos de infección en mamíferos. En particular, sicX también es un biomarcador para esta transición de crónica a aguda, ya que es el gen más regulado a la baja cuando una infección crónica se dispersa y causa septicemia aguda. Este trabajo resuelve una pregunta de hace décadas sobre la base molecular que subyace al cambio de crónico a agudo en P. aeruginosa y sugiere que el oxígeno es el principal impulsor ambiental de la letalidad aguda.

Muchas bacterias patógenas pueden colonizar a sus huéspedes y persistir crónicamente. En algunos casos, las bacterias se diseminan desde los sitios de infección inicial a otras partes del cuerpo, lo que provoca enfermedades sistémicas agudas. Una cuestión central en biología es comprender los mecanismos moleculares y las señales ambientales que controlan este cambio de estilo de vida. El patógeno humano oportunista P. aeruginosa puede causar infecciones tanto agudas como crónicas que son notoriamente difíciles de tratar. P. aeruginosa existe como células individuales (estilo de vida planctónico) o agregados encerrados en una matriz (estilo de vida de biopelículas), que se considera que favorecen las infecciones agudas y crónicas, respectivamente. Por lo tanto, los estudios de laboratorio se han centrado tradicionalmente en sondear la transición biopelícula-planctónica de P. aeruginosa in vitro, con el objetivo de comprender los cambios en el estilo de vida de este patógeno en humanos. Décadas de trabajo han demostrado cómo los sistemas reguladores globales, como el di-GMP cíclico de segundo mensajero3,4,5 y el sistema Gac-Rsm2,6,7,8,9,10,11,12, controlan la transición biopelícula-planctónica de P .aeruginosa in vitro, proporcionando información crítica sobre la historia de vida de esta bacteria. Sin embargo, hasta ahora, sigue siendo difícil de comprender cómo responde P. aeruginosa a las señales ambientales y, en consecuencia, cambia los estilos de vida de infección dentro del mamífero huésped. En este estudio, abordamos esta brecha en el conocimiento aprovechando los transcriptomas de P. aeruginosa adquiridos de muestras derivadas de humanos para descubrir y caracterizar mecánicamente un nuevo ARN pequeño, denominado sRNA inductor de infección crónica X (SicX), que gobierna la enfermedad crónica de P. aeruginosa. o decisión aguda durante la infección de mamíferos.

Anteriormente obtuvimos transcriptomas de P. aeruginosa de alta resolución de muestras de infección humana, incluidas muestras de esputo de pacientes con fibrosis quística y muestras de desbridamiento de pacientes con heridas crónicas13,14. Utilizando métodos de aprendizaje automático, identificamos 30 genes de P. aeruginosa cuyos niveles de expresión diferencian colectivamente el crecimiento de P. aeruginosa en humanos del de laboratorio13. Más de la mitad de estos genes no están caracterizados, lo que pone de relieve una brecha sustancial en el conocimiento de la biología de la infección humana por P. aeruginosa. Entre estos genes de función desconocida se incluye PA1414 (etiqueta de locus en la cepa PAO1 de P. aeruginosa), cuyo nivel de expresión en humanos fue 222 veces mayor que en el laboratorio, y su nivel de expresión es el más alto de los genes de P. aeruginosa expresados. durante la infección humana (Fig. 1a). A continuación, comparamos la abundancia relativa (transcripciones por millón (TPM)) de las transcripciones de PA1414 con las de otras transcripciones codificantes de proteínas (5.893 genes) y no codificantes (199 ARNs) 15 (Fig. 1b). En promedio, las transcripciones de PA1414 representaron el 13,85% del TPM en transcriptomas de P. aeruginosa adquiridos de muestras de infección crónica humana y, en particular, constituyeron casi el 50% del TPM total en algunos casos. Sin embargo, el nivel de expresión de PA1414 fue extremadamente bajo en P. aeruginosa cultivada en condiciones in vitro estándar. PA1414 es un gen pequeño (234 pares de bases de largo) de función desconocida. El examen de 261 genomas completos de P. aeruginosa identificó 258 ortólogos de PA1414 (Fig. 1c y Datos ampliados, Fig. 1), y no se identificaron homólogos en otras especies de Pseudomonas u otros organismos. Las secuencias de ADN de los ortólogos de PA1414, incluidas sus regiones promotoras aguas arriba, están altamente conservadas (Fig. 1d), lo que sugiere que PA1414 tiene una función conservada y la regulación de su expresión es universal en todos los aislados de P. aeruginosa.

a, Expresión genética diferencial de P. aeruginosa entre infecciones humanas y condiciones comunes in vitro. Para cada gen, el log2[cambio] se representa frente al valor P de la prueba de Wald. Las burbujas con bordes negros resaltan los 30 genes característicos de la infección humana por P. aeruginosa. El tamaño de la burbuja indica la abundancia de lecturas de ARNm durante las infecciones humanas. Las barras azules en el eje y indican genes (con valores log2 negativos [cambio de veces]) fuera del rango de escala. Las líneas grises discontinuas indican los límites (−log10[valor de P ajustado] > 2, |log2[cambio de veces]| > 1) para identificar genes expresados ​​diferencialmente. Los genes regulados al alza (verde) y regulados a la baja (azul) en humanos están codificados por colores de manera diferente. Las burbujas grises indican genes que no se expresan diferencialmente. b, Abundancia relativa de transcripción (TPM) de PA1414 en comparación con las de todas las demás secuencias codificantes de proteínas (CDS) y sRNA no codificantes en 54 transcriptomas examinados en a, ordenados del TPM de PA1414 más alto al más bajo. El TPM promedio de PA1414 se indica con líneas discontinuas. c, los ortólogos de PA1414 se encuentran solo en P. aeruginosa. Las barras verdes y negras indican la presencia y ausencia de ortólogos, respectivamente. d, conservación de la secuencia de ADN de PA1414 y sus genes vecinos entre 258 aislados de P. aeruginosa que contienen PA1414. A continuación, se muestra el porcentaje de ortólogos idénticos al alelo PA1414 de PA14 en cada nucleótido.

Datos fuente

P. aeruginosa puede prosperar en diversos nichos ecológicos dentro del cuerpo humano. Para comprender qué señales ambientales impulsan la expresión de PA1414, examinamos 202 transcriptomas de P. aeruginosa disponibles públicamente adquiridos en una variedad de entornos (Fig. 2a y Tabla complementaria 1). Descubrimos que PA1414 se expresaba en niveles altos en condiciones anaeróbicas y con poco oxígeno. De acuerdo con este hallazgo, un estudio inicial de microarrays también mostró que PA1414 se induce durante el crecimiento anaeróbico16. Además, se identificó un motivo de unión por consenso para el regulador transcripcional anaeróbico global, Anr16, aguas arriba de PA1414 (Datos ampliados, figura 2a). Utilizando un indicador lacZ que cuantifica la transcripción de PA1414, demostramos que, de hecho, este gen fue inducido 25 veces en condiciones anaeróbicas, y la mutagénesis de Anr o el motivo de unión abolió la expresión de PA1414 (Fig. 2b). PA1414 también se expresó a un nivel aproximadamente 18 veces mayor en cultivo estático (Fig. 2b), lo que indica que no se requieren condiciones anaeróbicas estrictas para su inducción. Además, el análisis de transferencia Northern proporcionó evidencia directa de que las transcripciones de PA1414 fueron muy abundantes durante el crecimiento anaeróbico pero no aeróbico (Fig. 2c). Para comparar directamente los niveles de expresión de PA1414 en humanos y en entornos con poco oxígeno, realizamos experimentos de secuenciación de ARN (RNA-seq) en P. aeruginosa durante el crecimiento estático in vitro (una condición con poco oxígeno), siguiendo el mismo método de preparación de biblioteca utilizado. en nuestro estudio de transcriptomas de P. aeruginosa en humanos14. Descubrimos que, aunque en condiciones de bajo oxígeno, la abundancia de transcritos (TPM) de PA1414 era siete veces menor que durante las infecciones humanas, PA1414 se encuentra entre los tres genes expresados ​​en los niveles más altos (de aproximadamente 6.000 genes de ARNs y codificadores de proteínas), lo que respalda la noción de que un nivel bajo de oxígeno es de hecho un factor principal para su alto nivel de expresión (Datos ampliados, Fig. 2b). Dado que P. aeruginosa a menudo encuentra ambientes con poco oxígeno durante la infección crónica humana17,18, estos datos indican que P. aeruginosa responde a esta señal ambiental del huésped aumentando el nivel de expresión de PA1414.

a, abundancia de ARN PA1414 (TPM) y la clasificación correspondiente (de todos los genes codificadores de proteínas y ARNs) en 202 transcriptomas de P. aeruginosa. Las líneas discontinuas indican los límites (PA1414 TPM > 103, clasificación PA1414 <102) para identificar transcriptomas con alta expresión de PA1414. b, ensayo de β-galactosidasa que examina la inducción de PA1414 en condiciones anaeróbicas y estáticas. PPA1414-lacZ, lacZ fusionado transcripcionalmente al promotor PA1414; PPA1414*, promotor PA1414 que contiene mutaciones en el motivo de unión a Anr; MrT7, transposón MAR2xT7. n ≥ 4 experimentos independientes. c, análisis de transferencia Northern de la expresión de PA1414. El tamaño estimado (nucleótidos, nt) se indica a la izquierda. El ARNr 5S sirvió como control de carga. Para obtener datos de la fuente del gel, consulte la Fig. 1. d complementaria, Crecimiento de biopelículas de colonias de ΔPA1414 y WT en diferentes orígenes de cepas de P. aeruginosa. Se indican la presencia y ausencia de oxígeno. La UFC de ΔPA1414 se normalizó frente a la UFC del WT en cada experimento (n = 4). Una línea discontinua resalta el punto donde la proporción de UFC = 1. e, Porcentaje de células resistentes a la tetraciclina (TetR) antes y después de los pases diarios en condiciones anaeróbicas (n = 3). TetS, sensible a tetraciclina; Δ, ΔPA1414. f, lecturas de RNA-seq alineadas con el locus PA1414 durante el crecimiento in vitro estándar y las infecciones humanas. El tono azul indica un terminador independiente de Rho en PA1414. g, Crecimiento de biopelículas de colonias de ΔsicX que albergan diferentes mutaciones de sicX en condiciones anaeróbicas. n = 4 experimentos independientes. h, el estudio proteómico comparativo identifica los objetivos de SicX tanto en condiciones estáticas como anaeróbicas. i, ensayo de β-galactosidasa que evalúa el control traduccional de SicX en ubiUVT en condiciones anaeróbicas (n ≥ 4). j, ensayo de β-galactosidasa que evalúa la transcripción de ubiUVT en ausencia de SicX o Anr en condiciones estáticas (n ≥ 8). k, Cuantificación de la síntesis anaeróbica de UQ9 en diferentes cepas (n = 4). l, Un modelo de regulación dual de la expresión de ubiUVT por Anr y SicX. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. Las diferencias significativas (en comparación con el WT) se indican con asteriscos (*P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001; ****P <0,0001; prueba de Mann-Whitney de dos colas).

Datos fuente

Luego consideramos si PA1414 afecta la fisiología anaeróbica de P. aeruginosa. Para estos experimentos, eliminamos PA1414 de la cepa PA14 de P. aeruginosa (la etiqueta de locus correspondiente en esta cepa es PA14_46160) y comparamos el crecimiento de ΔPA1414 con el de P. aeruginosa de tipo salvaje (WT) en condiciones aeróbicas y anaeróbicas (Fig. .2d). Utilizando un ensayo de biopelícula de colonia, encontramos que, mientras que la eliminación de PA1414 no afectó negativamente el crecimiento aeróbico de P. aeruginosa, ΔPA1414 exhibió rendimientos de crecimiento de aproximadamente la mitad que los de WT en condiciones anaeróbicas con nitrato como aceptor de electrones alternativo (Fig. 2d). Se realizaron observaciones similares en diferentes orígenes de cepas de P. aeruginosa, incluido un aislado clínico de fibrosis quística, B1 (Fig. 2d; ref. 19). Aunque demostramos que PA1414 también jugó un papel menor en el crecimiento planctónico anaeróbico (Datos extendidos, Fig. 2c), los experimentos de competencia en los que WT y ΔPA1414 se cultivaron planctónicamente (en una proporción inicial de 1: 1) y se pasaron diariamente en condiciones anaeróbicas revelaron ese WT superó a ΔPA1414 después del día 3 (Fig. 2e).

Luego investigamos el mecanismo molecular mediante el cual PA1414 controla el crecimiento anaeróbico. Aunque está anotado como un gen codificador de proteínas, descubrimos que durante la infección humana las transcripciones de PA1414 estaban restringidas al extremo 5 '(Fig. 2f), y también se observó un patrón similar en condiciones anaeróbicas (Datos ampliados, Fig. 2d). El claro enriquecimiento de transcripciones cortas que abarcan el codón de inicio anotado planteó la cuestión de si PA1414 codifica una proteína funcional o un pequeño ARN regulador (ARNs). Para abordar esta pregunta, introdujimos diferentes mutaciones en PA1414 y evaluamos si podrían restaurar el defecto de rendimiento de crecimiento de la biopelícula de la colonia ΔPA1414 en condiciones anaeróbicas (Fig. 2g y Datos ampliados Fig. 2e). Descubrimos que un codón de inicio o una mutación de cambio de marco (para prevenir la síntesis de proteínas) no afectó la función de PA1414, mientras que las sustituciones sinónimas en la región altamente transcrita (para interrumpir las posibles interacciones del ARNs con los ARNm diana o las proteínas de unión a ARN) la abolieron. su función. Además, un alelo truncado que abarca solo la región 5' altamente transcrita fue suficiente para restaurar el defecto de crecimiento anaeróbico en ΔPA1414, destacando aún más esta región funcional de PA1414. A través de análisis de transferencia Northern, demostramos que las diferencias de crecimiento observadas no se debieron a la abundancia diferencial de sRNA (Datos ampliados, figura 2f). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que PA1414 funciona como un ARNs (en adelante denominado SicX) que no es esencial pero promueve el crecimiento anaeróbico de P. aeruginosa in vitro.

Como los sRNA a menudo ejercen su regulación postranscripcionalmente20,21,22, llevamos a cabo proteómica cuantitativa de escopeta para identificar objetivos de SicX. Aquí, los proteomas de WT P. aeruginosa y ΔsicX se obtuvieron en dos condiciones de crecimiento en las que sicX se expresa en un nivel alto: poco oxígeno (es decir, crecimiento estático) y condiciones anaeróbicas estrictas. Identificamos siete proteínas (incluidas tres con funciones conocidas) que exhiben diferentes abundancias entre WT y ΔsicX en ambas condiciones de crecimiento (Fig. 2h y Tabla complementaria 2). Una de estas proteínas es UbiV, que está codificada por el operón ubiUVT23. Este operón codifica proteínas responsables de la biosíntesis anaeróbica de la ubiquinona, un transportador de electrones esencial para el metabolismo respiratorio en proteobacterias23. Aunque las otras dos proteínas codificadas por este operón, UbiU y UbiT, no estaban entre las siete proteínas identificadas con nuestros estrictos criterios, una investigación adicional reveló que ambas proteínas también mostraron niveles significativamente reducidos en ΔsicX en comparación con WT P. aeruginosa durante el crecimiento estático. (Tabla complementaria 2). Utilizando un indicador traduccional lacZ del operón ubiUVT, demostramos que la eliminación de sicX de hecho redujo seis veces la actividad traduccional de ubiUVT en condiciones anaeróbicas, y la complementación genética con sicX en trans restauró la traducción de ubiUVT (Fig. 2i). Además, SicX no afectó la transcripción de ubiUVT (Fig. 2j). Para proporcionar evidencia directa de cómo SicX regula la respiración anaeróbica, cuantificamos la abundancia de ubiquinona (más específicamente, UQ9) en WT y ΔsicX en condiciones anaeróbicas mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas y, de hecho, ΔsicX exhibió una reducción doble en UQ9 en comparación con WT ( Figura 2k). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que SicX induce postranscripcionalmente la expresión de UbiUVT. Nuestro hallazgo también proporciona información sobre la mayor abundancia de Dnr y HemF en ΔsicX (Fig. 2h), ya que Dnr puede inducir la vía de desnitrificación16 para aliviar el estrés anaeróbico en ΔsicX, y la expresión de HemF depende de Dnr24. En particular, encontramos que la transcripción de ubiUVT está bajo el control de Anr (Fig. 2j). En conjunto, estos resultados respaldan un modelo en el que Anr activa la transcripción de sicX y ubiUVT en respuesta a la privación de oxígeno. A su vez, SicX induce postranscripcionalmente la biosíntesis de ubiquinona para dar forma a la fisiología anaeróbica de P. aeruginosa (Fig. 2l).

A continuación, exploramos cómo SicX activa la traducción del ARNm de ubiUVT. El análisis in silico a través de IntaRNA25 identificó una supuesta interacción de emparejamiento de bases entre SicX y la región no traducida (UTR) 5 'del operón ubiUVT (Datos extendidos, Fig. 3a). Las estructuras secundarias predichas con Mfold26 indican que un tallo-bucle dentro de la UTR 5 'de ubiUVT ocluye el sitio de unión al ribosoma de ubiU, mientras que el emparejamiento de bases con SicX tiene el potencial de liberar el sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción. Para probar esto experimentalmente, llevamos a cabo análisis mutacionales extensos de sicX y la UTR 5 'de ubiUVT, y el resultado funcional de cada mutación puntual (37 en total) se evaluó a través de un reportero lacZ fusionado traslacionalmente a ubiUVT (Datos extendidos, Fig. 3a). ,b). De acuerdo con la predicción in silico, identificamos mutaciones dentro de la región semilla de SicX (para el emparejamiento de bases con el ARNm de ubiUVT) y la región objetivo en la UTR 5' de ubiUVT que condujeron a una activación traduccional reducida de ubiUVT, mientras que las mutaciones en otras regiones generalmente tuvo efectos limitados (Datos ampliados Fig. 3a, b). Además, una mutación puntual en la región semilla de SicX que redujo la traducción de ubiUVT se puede restaurar parcialmente restableciendo el emparejamiento de bases en la UTR 5 'de ubiUVT (Datos ampliados, figura 3b). Sin embargo, cabe señalar que la restauración traslacional observada puede deberse en parte a la mutación en la UTR 5 'de ubiUVT, que aumentó la traducción de ubiUVT incluso en ausencia de SicX (Datos ampliados, figura 3c), probablemente al desestabilizar el vástago-bucle. . Finalmente, demostramos que la chaperona de ARN Hfq27 no es necesaria para la inducción de la traducción ubiUVT mediante SicX (Datos ampliados, figura 3d). Aunque se sabe que Hfq facilita las interacciones entre los ARNs y los ARNm diana en muchos casos, las interacciones entre ARNs y ARNm independientes de Hfq han sido bien documentadas28,29,30. Sobre la base de nuestros resultados genéticos, proponemos un modelo de emparejamiento de bases independiente de Hfq para la estimulación SicX de la traducción ubiUVT, que se probará en el futuro. En particular, las regiones de emparejamiento de bases predichas en SicX y la UTR 5 'de ubiUVT son idénticas en todos los genomas de P. aeruginosa examinados (Datos ampliados, figuras 4a-c) y, por lo tanto, este mecanismo de regulación puede ser universal en P. aeruginosa.

Aunque ahora tenemos una comprensión más detallada de la función de SicX in vitro, aún se desconoce cómo afecta SicX a la patogénesis de P. aeruginosa. Aquí abordamos esta pregunta introduciendo WT P. aeruginosa y ΔsicX en un modelo de herida crónica de ratón (Fig. 3a). Se eligió este modelo porque se ha demostrado cuantitativamente que recapitula con precisión la expresión del gen P. aeruginosa en infecciones crónicas humanas 13, y el ARNs SicX en este modelo se expresa de manera similar al de los humanos (Fig. 2a y Datos ampliados Fig. 5a, b). El modelo implica la infección de heridas dorsales de espesor total creadas quirúrgicamente31 (Fig. 3a). Se considera un modelo crónico y no letal porque P. aeruginosa generalmente persiste en el sitio de la infección durante semanas sin causar diseminación sistémica. Diez días después de la infección, evaluamos la carga bacteriana en los tejidos de la herida, así como la diseminación al bazo. En los tejidos de las heridas, los niveles bacterianos fueron similares entre WT P. aeruginosa y ΔsicX (Fig. 3b), lo que indica que la falta de SicX no afecta la colonización. Sin embargo, mientras que solo 2 de 21 ratones infectados con WT mostraron diseminación al bazo, 12 de 20 ratones infectados con ΔsicX mostraron diseminación sistémica (prueba exacta de Fisher de dos colas, P = 0,0009; Fig. 3c). Además, ΔsicX causó una mayor letalidad (Fig. 3d), lo que no se observa comúnmente con WT P. aeruginosa en este modelo. La diseminación generalmente ocurrió cuando la carga de la herida era alta (> 108 unidades formadoras de colonias (UFC) g-1; Fig. 3c). Sin embargo, entre los ratones que tenían una alta carga de heridas (>108 UFC g-1), ΔsicX causó más infección sistémica (12 de 15) en comparación con WT (2 de 11), lo que indica que la diseminación no dependía únicamente de la carga de la herida. (prueba exacta de Fisher de dos colas, P = 0,0043; Fig. 3c). Además, estas observaciones no se deben a la aptitud diferencial de WT y ΔsicX en los bazos. Esto se demostró utilizando un modelo de infección cutánea aguda en el que la infección sistémica se produce poco después de la inyección subcutánea en la parte interna del muslo del ratón. En este modelo, WT y ΔsicX exhibieron una colonización y un crecimiento similares en el bazo (Datos ampliados, figura 6). En conjunto, nuestros datos indican que SicX es un actor clave en la infección crónica por P. aeruginosa, cuya alta expresión promueve la infección crónica localizada.

a, Esquema del modelo de herida crónica en ratón (infección de 10 días). b, carga de P. aeruginosa en las heridas. Las líneas indican medios. c, carga de P. aeruginosa en el bazo (eje y). La carga de herida correspondiente se indica en el eje x. d, Curvas de supervivencia de ratones infectados con WT (n = 24) y ΔsicX (n = 24). e, La restauración de la traducción de ubiUVT en ΔsicX impidió la diseminación y la eliminación de ubiUVT en WT provocó la diseminación. f, organización espacial de P. aeruginosa en heridas. C, núcleo; E, borde. g, Esquema del modelo de neumonía en ratón (infección de 2 días). h, carga de P. aeruginosa en los pulmones. Las líneas indican medios. Yo, carga de P. aeruginosa en el bazo. Las líneas indican medios. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney de dos colas para comparar las diferencias en la carga bacteriana en b,c,h,i. Se utilizaron la prueba de rangos logarítmicos y la prueba de rangos con signo de pares emparejados de Wilcoxon de dos colas para d,f, respectivamente. Resumen de n = 6 experimentos independientes para b – d; n = 3 experimentos independientes para e,f; n = 2 experimentos independientes para h,i. NS, no significativo.

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Para determinar si la mayor diseminación y letalidad de la infección por ΔsicX está relacionada con la reducción de la producción de ubiquinona anaeróbica, primero desacoplamos la traducción de ubiUVT de SicX mediante la creación de una cepa de P. aeruginosa (ΔsicX-ubiC) que traduce constitutivamente UbiUVT, incluso en ausencia de SicX (Datos ampliados Fig. 7a, b). Esto se logró mediante la introducción de mutaciones puntuales en la UTR 5 'de ubiUVT que probablemente alteran su estructura secundaria y permiten la traducción activa. ΔsicX-ubiC creció hasta obtener rendimientos similares a los de WT P. aeruginosa y rendimientos significativamente más altos que los de ΔsicX en condiciones anaeróbicas in vitro (Datos ampliados, Fig. 7c), y esto se debió a la restauración de la síntesis anaeróbica de ubiquinona (Fig. 2k). ). A continuación, utilizando el modelo de herida crónica de ratón, encontramos que ΔsicX-ubiC no exhibió diseminación sistémica (Fig. 3e). También eliminamos el operón ubiUVT de WT P. aeruginosa, y la cepa resultante no creció anaeróbicamente (Datos ampliados, Fig. 7d) debido al defecto en la síntesis anaeróbica de ubiquinona23. En particular, aunque todas las cepas exhibieron cargas bacterianas similares en la herida (Datos ampliados, Fig. 5c), se observó diseminación sistémica solo en la infección por ΔsicX y ΔubiUVT (Fig. 3e), lo que indica que una síntesis suficiente de ubiquinona anaeróbica contribuye a la infección crónica localizada. Aunque el mecanismo de cómo la abundancia de ubiquinona influye en los estilos de vida infectados no está claro, encontramos que afecta la distribución espacial a macroescala de las células de P. aeruginosa en la herida: las células WT permanecieron preferentemente en el centro de la herida donde se inocularon originalmente las células, y las infectadas con ΔsicX Las heridas contenían células equivalentes en el centro y los bordes exteriores de las heridas (Fig. 3f). Esto está respaldado por nuestros hallazgos proteómicos que muestran que ΔsicX exhibió niveles elevados de dos proteínas (codificadas por PA0223 y PA0224) que son biomarcadores de P. aeruginosa32 dispersa (Tabla complementaria 2). Además, ΔubiUVT mostró un patrón de organización espacial similar al de ΔsicX (Fig. 3f). Teniendo en cuenta que la herida probablemente alberga gradientes de oxígeno, especulamos que estas diferentes distribuciones espaciales reflejan en parte la disponibilidad variable de oxígeno en la herida. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la biosíntesis anaeróbica reducida de ubiquinona promueve la diseminación de ΔsicX.

P. aeruginosa es conocida por causar una variedad de infecciones pulmonares y, por lo tanto, también evaluamos el papel de SicX en la colonización y diseminación utilizando un modelo de neumonía en ratón (Fig. 3g). En este caso, P. aeruginosa establece una infección en el pulmón después de la administración intranasal, lo que a su vez puede conducir a una diseminación sistémica dependiendo de la virulencia de las cepas individuales. Descubrimos que los ratones infectados con dosis subletales de variantes WT y ΔsicX de PA14, una cepa altamente virulenta, tenían cargas bacterianas similares en los pulmones 48 h después de la infección (Fig. 3h). Por el contrario, la carga bacteriana en el bazo de los ratones infectados con ΔsicX fue aproximadamente 100 veces mayor que la de los ratones infectados con WT, y la complementación con el alelo sicX truncado (representado en la Fig. 2g) en trans redujo la diseminación (Fig. 3i). , lo que indica que la falta de SicX promueve la infección sistémica. Además, llevamos a cabo experimentos utilizando otra cepa, PAO1, que es menos virulenta que PA14. Descubrimos que WT y ΔsicX exhibieron una colonización similar en los pulmones, y mientras que solo dos de nueve ratones infectados con WT mostraron diseminación al bazo, ocho de nueve ratones infectados con ΔsicX mostraron diseminación sistémica (prueba exacta de Fisher de dos colas, P = 0,015 ; Datos ampliados Fig. 8). Estas observaciones indican que SicX promueve la infección crónica localizada en múltiples modelos de infección de mamíferos.

Como la presencia o ausencia de SicX dicta distintos estilos de vida de infección, a continuación consideramos si la abundancia de sRNA de SicX cambia durante la transición entre infecciones crónicas y agudas. Para probar esto, utilizamos el modelo de herida crónica de ratón en el que primero se permitió que WT P. aeruginosa estableciera una infección local y luego se trató con glucósidos hidrolasas (GH) o ácido cis-2-decenoico (cis-DA) para inducir la diseminación sistémica. imitando la transición de crónica a aguda (Fig. 4a). Se utilizaron GH y cis-DA porque ofrecen distintos mecanismos que impulsan la dispersión de biopelículas: las GH se dirigen a los exopolisacáridos de biopelículas hidrolizando los enlaces glicosídicos para inducir pasivamente la dispersión33,34,35, mientras que cis-DA es una molécula de señalización de ácido graso que impulsa activamente la dispersión mediante que regulan la expresión y la fisiología de genes bacterianos36,37,38. Es importante destacar que se ha demostrado que la dispersión de biopelículas inducida por GH en este modelo puede causar septicemia letal35. Aquí comparamos los transcriptomas de P. aeruginosa antes (es decir, biopelículas maduras en tejidos de heridas) y después (es decir, células dispersas) del tratamiento con GH o cis-DA (Fig. 4b). Los análisis de enriquecimiento funcional respaldan la idea de que las GH y cis-DA indujeron diferentes cambios fisiológicos y metabólicos durante la dispersión in vivo (Datos ampliados, figura 9). Sorprendentemente, entre los genes que se expresaron diferencialmente en respuesta a ambos tratamientos, encontramos que sicX fue el gen con mayor regulación negativa (Fig. 4c), lo que respalda la idea de que los niveles de SicX cambian notablemente durante la transición de crónica a aguda. También encontramos que los genes implicados en la síntesis de alginato (algA y algD) y la exportación (algE) estaban regulados negativamente durante la dispersión de la biopelícula (Fig. 4d). Además, la vía de desnitrificación (genes cofactores nir, nar y molibdopterina en respuesta a GH; genes nir y nor en respuesta a cis-DA) y oxidasas de alta afinidad por el oxígeno (oxidasa tipo cbb3 en respuesta tanto a GH como a cis-DA ) estaban reguladas a la baja, mientras que las oxidasas de baja afinidad por el oxígeno (Cyo oxidasa en respuesta a las GH) estaban reguladas al alza (Fig. 4d), lo que indica un aumento de la disponibilidad de oxígeno durante la dispersión. En conjunto, nuestras observaciones identifican sicX como un biomarcador para la transición de crónica a aguda y sugieren que el oxígeno es una señal ambiental clave durante este proceso.

a, Esquemas de dispersión in vivo de biopelículas maduras en heridas crónicas de ratones. b, diagrama de Venn de genes expresados ​​diferencialmente antes (n = 3 animales) y después del tratamiento con GH (n = 2) o cis-DA (n = 2). c, sicX (naranja) es el gen con mayor regulación negativa entre los 132 genes expresados ​​diferencialmente identificados bajo tratamientos con GH y cis-DA. d, Mapa de calor de genes expresados ​​diferencialmente (DE) implicados en la síntesis y secreción de alginato, la respiración anaeróbica y la respiración aeróbica. Están indicadas las oxidasas terminales aeróbicas con afinidades altas o bajas por el oxígeno. Las celdas en blanco indican genes no identificados como expresados ​​diferencialmente. e, Un modelo funcional de cómo SicX permite que P. aeruginosa establezca una infección local crónica en un entorno huésped con poco oxígeno. SicX nulo o bajo promueve la infección sistémica.

Datos fuente

En conclusión, al aprovechar los transcriptomas bacterianos de infecciones humanas, descubrimos que P. aeruginosa produce un ARNs que responde al oxígeno, SicX, cuya abundancia orquesta la transición entre infecciones crónicas y agudas (Fig. 4e). La capacidad de responder a entornos estresantes es crucial para la supervivencia de muchos organismos, durante los cuales los ARNs desempeñan funciones clave en el ajuste de la expresión genética. Por ejemplo, en la infección por Salmonella, el sRNA PinT se induce y regula la expresión génica para facilitar la transición de la etapa de invasión a la supervivencia intracelular39. En otro caso, Helicobacter pylori silencia la expresión del ARNs HPnc4160 durante la infección, lo que regula positivamente los genes diana para promover la colonización bacteriana en el huésped y aumentar potencialmente el riesgo de carcinogénesis gástrica40. En este estudio, proporcionamos un caso convincente de un ARNs que dirige importantes elecciones de estilo de vida durante la infección por P. aeruginosa. Además, SicX se muestra prometedor como biomarcador de pronóstico y diagnóstico, ya que es el gen con mayor capacidad de respuesta durante la transición de crónica a aguda.

Aunque décadas de estudios in vitro han definido sistemas reguladores clave que gobiernan la transición biopelícula-planctónica en P. aeruginosa, falta evidencia sólida que respalde sus funciones en el huésped mamífero. Por ejemplo, la cascada de señalización Gac-Rsm está muy extendida en muchas especies bacterianas y se sabe que modula la expresión de características asociadas con el estilo de vida planctónico o de biopelículas en P. aeruginosa. Esta cascada se basa en las interacciones entre los reguladores postranscripcionales globales (RsmA o RsmN (también conocido como RsmF)) y los sRNA de Rsm para ajustar la expresión génica6 (Datos ampliados, figura 10a). Sin embargo, encontramos que los ARNs de Rsm se expresan solo en niveles bajos en pacientes crónicamente infectados con P. aeruginosa (Datos ampliados, Fig. 10b, c), lo que indica que participan mínimamente en el mantenimiento de la infección a largo plazo. A continuación, aunque los estudios han demostrado que la inactivación de componentes específicos de Gac-Rsm condujo a defectos de aptitud o colonización en modelos de infección aguda7,41, sigue faltando evidencia convincente que respalde un modelo de cambio de estilo de vida durante la infección de mamíferos. Además, encontramos que la regulación de la expresión de SicX es independiente del sistema de dos componentes GacS-GacA (Datos ampliados, figura 10d). Además, la cepa primaria de P. aeruginosa utilizada en este estudio (PA14) tiene una mutación en ladS, una quinasa sensora que estimula la actividad GacS-GacA y promueve las características de la biopelícula42; sin embargo, esta cepa aún estableció una infección crónica localizada en el modelo de herida crónica del ratón. (Figura 3b). Como muchas otras bacterias patógenas, P. aeruginosa coloniza una amplia gama de nichos ecológicos, incluidos ecosistemas libres de huéspedes, y como resultado, ciertas características reguladoras que controlan la transición biopelícula-planctónica pueden haber sido seleccionadas en condiciones que no están relacionadas con la patogénesis humana. Por lo tanto, nuestro estudio proporciona un marco para descubrir rasgos patógenos importantes aprovechando la información de expresión de genes bacterianos de infecciones humanas.

Las células de P. aeruginosa se cultivaron de forma rutinaria en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI) a 37 °C con agitación (250 rpm), a menos que se especifique lo contrario. Se utilizó agar de aislamiento de Pseudomonas (PIA) para seleccionar P. aeruginosa frente a otros microbios. Se cultivaron células de Escherichia coli en caldo de lisogenia. Para preparar las placas se utilizó agar al 1,5% (p/v). Se agregaron antibióticos al medio según fue necesario: 60 µg ml-1 de gentamicina, 75 µg ml-1 de Tet o 300 µg ml-1 de carbenicilina para P. aeruginosa; 10 µg ml-1 de gentamicina, 10 µg ml-1 de Tet o 100 µg ml-1 de carbenicilina para E. coli. Para el cultivo estático o anaeróbico de P. aeruginosa, se añadió KNO3 50 mM al caldo BHI. La condición anaeróbica se mantuvo en una cámara anaeróbica de vinilo (Coy Lab Products) con la siguiente atmósfera: 85% N2, 10% CO2 y 5% H2.

Las cepas, plásmidos y cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 3. Para crear fusiones transcripcionales lacZ (pPC100–102), las regiones promotoras deseadas se amplificaron por PCR (Q5, New England Biolabs) utilizando ADN genómico PA14 como plantilla, y el Los amplicones resultantes que contenían regiones superpuestas de aproximadamente 25 pares de bases (pb) se ligaron en el vector mini-CTX-lacZ (linealizado con EcoRI y KpnI) en Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs). Para crear plásmidos de complementación sicX (pPC103-106), el promotor sicX y los alelos sicX (que contienen mutaciones como se describe en la Tabla complementaria 3) se ligaron en el vector mini-CTX1 (linealizado con EcoRI y KpnI) mediante el ensamblaje de Gibson. Todas las mutaciones puntuales sicX (pPC107–124) se construyeron con el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (New England Biolabs), utilizando mini-CTX1-sicXTruncate (pPC106) como plantilla. Para crear fusiones traslacionales lacZ (pPC125-126), la región promotora de ubiU se amplificó por PCR y luego se ligó en pSW205 entre los sitios EcoRI y BamHI. Todas las mutaciones puntuales ubiUVT 5 'UTR (pPC127–145) se construyeron con el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (New England Biolabs), utilizando pSW205-Pubi-lacZ (pPC125) como plantilla. Para construir plásmidos utilizados para la eliminación de genes sin marcadores (pPC146–147, 149–150) y la mutagénesis (pPC148), se amplificaron por PCR las regiones aguas arriba y aguas abajo (aproximadamente 1000 pb) que flanquean el gen o la región objetivo (que contienen mutaciones en la región superpuesta si es necesario). ) y se ligó en pEXG2 (linealizado con SacI y KpnI) mediante ensamblaje de Gibson. Todos los plásmidos se verificaron mediante PCR, digestión con enzimas de restricción y, si fuera necesario, secuenciación de ADN.

Luego, los plásmidos verificados se transformaron en E. coli SM10 λpir, seguido de la conjugación en P. aeruginosa PA14, PAO1, B1 y sus derivados. Los plásmidos derivados de pSW205 se electroporaron directamente en P. aeruginosa. Se utilizaron antibióticos apropiados para la selección como se indica en la Tabla complementaria 3. Para crear una eliminación o mutagénesis en el marco sin marcadores, se contraseleccionaron conjugantes con el casete de eliminación integrado en los loci objetivo en placas de agar con caldo de lisogenia bajo en sal suplementadas con sacarosa al 5%. . La eliminación exitosa se examinó mediante PCR utilizando cebadores flanqueantes y se verificó mediante secuenciación de ADN si era necesario.

Se llevaron a cabo búsquedas explosivas en pseudomonas.com y en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica para identificar ortólogos de sicX y ubiUVT en todo el género Pseudomonas y otros organismos. Se utilizaron la secuencia sicX (para la Fig. 1c y la Fig. 1 de datos extendidos), sicX con sus genes vecinos (Fig. 1d) y ubiUVT con su región intergénica aguas arriba (para la Fig. 4 de datos extendidos) de la cepa P. aeruginosa PA14. como consultas. Los ortólogos identificados a partir de genomas bacterianos completos con valores de E de <1 × 10−4, porcentaje de identidad> 90 % y valores de cobertura de consultas de> 90 % se conservaron para análisis posteriores. Las secuencias de ortólogos sicX y ubiUVT se alinearon utilizando MUSCLE43. Para analizar la conservación de la secuencia de los ortólogos sicX y ubiUVT, primero alineamos los ortólogos sicX y ubiUVT usando MUSCLE. A continuación, se recortaron los extremos de la alineación y se eliminaron los espacios, y se calcularon porcentajes de secuencias de ortólogo que son idénticas a las consultas sicX y ubiUVT en cada posición de nucleótido en R. Para crear datos extendidos Fig. 4b, c, las alineaciones se visualizaron en Jalview44 usando el esquema de color de nucleótidos predeterminado.

Se cultivaron células de P. aeruginosa durante la noche en caldo BHI suplementado con KNO3 50 mM. El cultivo nocturno se diluyó hasta una densidad óptica a 600 nm (OD600 nm) de aproximadamente 0,05 en caldo BHI fresco (con KNO3 50 mM) y luego se cultivó hasta la fase logarítmica (OD600 nm alrededor de 0,5). Las células en fase logarítmica se diluyeron a OD600 nm 0,2 y se transfirieron a la cámara anaeróbica para un cultivo con agitación (a 100 rpm) de 3 h a 37 °C. Se usó un volumen de 100 µl del cultivo anaeróbico para realizar el ensayo de β-galactosidasa (como se describe en la referencia 45). Se utilizaron cultivos aeróbicos en fase logarítmica como comparaciones. Para el cultivo estático, los cultivos en fase logarítmica se diluyeron a una DO600 nm 0,05 y se incubaron en una placa de 96 pocillos (500 µl en cada pocillo de 1 ml de profundidad) de forma estática a 37 °C durante 3 h. Luego se utilizaron los cultivos estáticos para el ensayo de β-galactosidasa.

Para hacer los datos extendidos Fig. 3a, b, se detectaron cepas que albergaban fusiones traduccionales ubiUVT-lacZ (3 μl de cultivos OD600nm 0,1) en membranas de policarbonato grabadas en pista Nuclepore de 0,2 μm (Whatman) que se colocaron (con el lado rugoso hacia arriba) en Placas de agar BHI que contienen 200 µg ml-1 X-gal, KNO3 50 mM y 100 µg ml-1 de carbenicilina. Luego, las placas se incubaron en la cámara anaeróbica (protegida de la luz) a 37 °C durante 20 h antes de obtener imágenes. Las actividades de β-galactosidasa se estimaron como se describió anteriormente46. Brevemente, las imágenes de biopelículas de colonias se convirtieron a 8 bits en ImageJ. Se llevó a cabo un umbral para definir los objetos de la colonia para las mediciones. Se midió la intensidad media de píxeles para cada colonia y se restó con la intensidad media de píxeles de una colonia de WT PA14.

Se cultivaron células de P. aeruginosa de forma aeróbica y anaeróbica para la extracción total de ARN. Para preparar cultivos aeróbicos, las células en fase logarítmica se diluyeron a OD600 nm 0,01 en BHI (con KNO3 50 mM) y se incubaron a 37 °C con agitación durante 3 h. Para preparar cultivos anaeróbicos, las células en fase logarítmica se diluyeron a OD600 nm 0,1 en BHI (con KNO3 50 mM) y se incubaron en la cámara anaeróbica durante 4 h con agitación a 37 °C. Para la extracción de ARN total, los cultivos de P. aeruginosa se almacenaron primero en RNAlater a 4 °C durante la noche. A continuación, las células se sedimentaron y se resuspendieron en tampón TE libre de RNasa que contenía 1 mg ml-1 de lisozima. Las muestras se incubaron a 37 °C durante 30 minutos para lisar enzimáticamente las células. Luego se añadió un volumen de 1 ml de RNA-Bee y las células se lisaron mecánicamente adicionalmente batiendo las perlas tres veces durante 30 s. Se añadió un volumen de 200 μl de cloroformo a las muestras y las fases acuosa y orgánica se separaron mediante centrifugación a 13.000 g durante 30 min a 4 °C. La fase acuosa que contenía ARN se mezcló con 0,5 ml de isopropanol y 20 µg de acrilamida lineal. Después de una incubación durante la noche a -80 °C, se sedimentó el ARN y se lavó con etanol al 75%. Los sedimentos secados al aire se resuspendieron en 100 µl de agua libre de RNasa. La concentración de ARN para cada muestra se determinó con un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Se separó aproximadamente 1 μg de ARN total en un gel de electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% y urea y se transfirió a membranas Hybond-N+ (GE Healthcare). Luego, las membranas se entrecruzaron con un reticulante ultravioleta (UVP) y se sondaron en una solución de hibridación (Takara) con los oligonucleótidos de ADN indicados (enumerados en la Tabla complementaria 3) que se marcaron radiactivamente con [γ-32P]ATP (Perkin Elmer) mediante la polinucleótido quinasa T4. (Biolabs de Nueva Inglaterra). Las membranas sondadas se expusieron a una pantalla de fósforo y se visualizaron utilizando un generador de imágenes biomoleculares Typhoon (GE Healthcare). Cuando fue necesario, se quitaron las membranas incubándolas con SDS al 0,1% hervido con agitación durante 15 minutos tres veces. Los tamaños de ARN se estimaron con la escalera de ARN de rango bajo RiboRuler (Thermo Fisher Scientific), así como la migración de xileno cianol (aproximadamente 28 nt) y azul de bromofenol (aproximadamente 8 nt).

Los cultivos bacterianos en BHI (con KNO3 50 mM) se cultivaron hasta la fase logarítmica (DO600 nm alrededor de 0,5) y luego se diluyeron hasta DO600 nm 0,02 con medio nuevo. A continuación, se colocaron 10 µl de cultivos diluidos en membranas de policarbonato grabadas en pista Nuclepore de 0,2 µm (Whatman) que se colocaron (con el lado liso hacia arriba) en placas de agar BHI (con KNO3 50 mM). Luego las placas se incubaron en la cámara anaeróbica a 37 °C durante 16 h. Las membranas que contenían biopelículas de P. aeruginosa se transfirieron a los tubos precargados BeadBug que contenían 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las biopelículas se rompieron mecánicamente batiendo perlas durante 45 s. Las UFC se determinaron esparciendo las suspensiones celulares diluidas en placas PIA.

Se recogieron células PA14 y ΔsicX de P. aeruginosa en condiciones de crecimiento tanto estáticas como anaeróbicas como se describe anteriormente (en la sección titulada ensayo de β-galactosidasa).

Para condiciones de crecimiento estático, se recolectaron tres réplicas biológicas para cada cepa. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis (Tris-HCl 100 mM, NaCl 50 mM, glicerol al 10% (v/v), Tris(2-carboxietil)fosfina 1 mM (TCEP), pH 7,5) con un minicóctel inhibidor de proteasa completo. (Roche). Después de tres rondas de sonicación (3 × 10 s) en hielo, los sobrenadantes se clarificaron mediante sedimentación (21.130 g, 15 min, 4 °C). Se redujeron alícuotas (100 μg) de cada muestra con TCEP, se alquilaron con yodoacetamida y se marcaron con etiquetas de masa en tándem (TMT). El etiquetado TMT se realizó según el protocolo especificado por el fabricante (Thermo Fisher).

Los experimentos de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) se llevaron a cabo utilizando un sistema LC de nano-ultrarendimiento LC de separación rápida (RSLC) Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific) y un espectrómetro de masas Lumos Orbitrap (Thermo Fisher Scientific). La separación de péptidos se llevó a cabo mediante cromatografía de fase inversa C18 a un caudal de 300 nl min-1 usando una columna de pulverización nano EASY de fase inversa Thermo Scientific (Thermo Scientific PepMap C18; tamaño de partícula de 2 mm, poro de 100 Å). tamaño, 75 mm de diámetro interior por 50 cm de largo). El disolvente A era agua/0,1 % de ácido fórmico y el disolvente B era 80 % (v/v) de acetonitrilo/20 % de agua/0,1 % de ácido fórmico. El gradiente lineal utilizado fue del 2 % al 40 % de disolvente B durante 93 min (el tiempo total de ejecución de LC fue de 120 min, incluida una etapa de lavado con alto contenido orgánico y el reequilibrio de la columna).

Los péptidos eluidos se pulverizaron en el espectrómetro de masas mediante una fuente EASY-Spray (Thermo Fisher Scientific). Todos los valores de m/z que representan iones peptídicos eluidos se midieron en un analizador de masas Orbitrap (configurado a una resolución de 120.000) y se escanearon entre m/z 380 y 1.500 Da. Se utilizaron escaneos MS/MS dependientes de los datos (velocidad máxima) para aislar y fragmentar automáticamente los iones precursores mediante disociación inducida por colisión (valor de energía de colisión normalizado, 35%) analizados en la trampa de iones lineal. Los iones con carga única y los iones con estados de carga no asignados se excluyeron de la selección para MS/MS y se utilizó una ventana de exclusión dinámica de 70 s. Luego se seleccionaron los 10 iones de fragmentos más abundantes de cada evento MS/MS para una etapa adicional de fragmentación mediante selección de precursores sincrónicos y MS/MS/MS47 en la celda de colisión de alta energía usando disociación colisional de alta energía (energía de colisión normalizada). valor del 65%). Los valores m/z y las abundancias relativas de cada ion indicador y de todos los fragmentos (rango de masas, 100 a 500 Da) en cada paso de MS3 se midieron en el analizador Orbitrap, que se configuró a una resolución de 60.000. Esto se llevó a cabo en ciclos de 10 eventos MS3, después de lo cual el instrumento Lumos volvió a escanear las proporciones m/z de los iones peptídicos intactos y el ciclo continuó.

Se utilizaron Proteome Discoverer v2.1 (Thermo Fisher Scientific) y Mascot (Matrix Science) v2.6 para procesar archivos de datos sin procesar. Los datos se alinearon con las secuencias de P. aeruginosa UCBPP-PA14 (con depósito común de proteínas adventicias (cRAP) v1.0). Se utilizó el paquete R MSnbase v2.13 (ref. 48) para procesar datos proteómicos. Las abundancias diferenciales de proteínas se evaluaron utilizando el paquete Limma v3.44.3 (ref. 49). Las diferencias en la abundancia de proteínas se determinaron estadísticamente mediante la prueba t de Student con variaciones moderadas mediante el uso del método empírico de Bayes de Limma. Los valores de P se ajustaron para pruebas múltiples mediante el método de Benjamini-Hochberg50. Se consideró que las proteínas habían aumentado o disminuido en abundancia solo cuando su valor log2 [cambio de veces] era mayor que 1 o menor que −1, respectivamente, y cuando su valor de P era <0,01.

Para la condición de crecimiento anaeróbico, se recogieron dos réplicas biológicas para PA14 y tres réplicas biológicas para ΔsicX como se describe anteriormente (en la sección titulada ensayo de β-galactosidasa). Brevemente, las proteínas de cada muestra se redujeron, alquilaron y digirieron con tripsina de acuerdo con el protocolo de preparación de muestras asistido por filtración51. Los péptidos se marcaron con TMT y se separaron mediante cromatografía de fase reversa de pH alto como se describió anteriormente52. Se agruparon en 12 fracciones como se describió anteriormente53. Cada fracción se analizó mediante nano-LC-MS/MS y los péptidos se identificaron como se describió anteriormente54 con las siguientes modificaciones. La cromatografía de fase inversa se llevó a cabo utilizando una columna empaquetada interna (40 cm de largo x 75 µm de diámetro interior x 360 µm de diámetro exterior, perlas de 1,9 µm de Dr. Maisch GmbH ReproSil-Pur 120 C18-AQ) y una columna de 120 min. degradado. Se buscaron los archivos Raw utilizando el algoritmo Mascot (v2.5.1) en una base de datos de proteínas construida combinando las secuencias de P. aeruginosa UCBPP-PA14 y una base de datos de contaminantes (cRAP, descargada el 21 de noviembre de 2016 desde http://www.thegpm. org) a través de Proteome Discoverer v2.1. Para nuestros análisis, como se describe anteriormente, solo se utilizaron coincidencias espectrales de péptidos con un valor esperado inferior a 0,01 ("alta confianza").

Para preparar las células para extracciones de lípidos, primero diluimos cultivos en fase logarítmica (OD600nm 0,5; cultivados aeróbicamente) en el caldo anaeróbico BHI (complementado con KNO3 50 mM) hasta una DO600nm calculada de 0,05, y después de una incubación anaeróbica de 6 h con agitación, las células Se recogieron, se lavaron una vez con PBS y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. El número de células se estimó con una DO600 nm.

Las muestras congeladas se descongelaron en hielo. Se añadió un volumen de 100 µl de isopropanol helado con coenzima Q10-d9 10 nM (UQ10 deuterado como estándar interno; Sigma-Aldrich) a 109 células. Con la adición de perlas de vidrio, las muestras se agitaron brevemente y se homogeneizaron con TissueLyzer durante 5 minutos dos veces, seguido de una centrifugación a 21.100 g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, el sobrenadante se diluyó diez veces y se transfirió a 4 °C. La LC-MS de ultrarendimiento se llevó a cabo utilizando un UltiMate 3000 equipado con una columna Accucore C30 (2,1 × 150 mm, tamaño de partícula de 2,6 µm; Thermo Fisher) y acoplado a un sistema de espectrometría de masas Orbitrap ID-X.

El método cromatográfico para el análisis de muestras implicó la elución con acetonitrilo/agua (60:40, v/v) con formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0,1% (fase móvil A) e isopropanol/acetonitrilo (90:10, v/v) con Formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0,1 % (fase móvil B) a un caudal de 0,4 ml min-1 utilizando el siguiente programa de gradiente: 0 min 20 % B; 1 minuto 60 % B; 5 minutos 70% B; 5,5 minutos 85 % B; 8 minutos 90 % B; 8,2 min 100% B mantenido hasta 10,5 min, luego 10,7 min 20% B mantenido hasta 12 min. La temperatura de la columna se ajustó a 50 °C y el volumen de inyección fue de 5 µl.

Las moléculas objetivo UQ9 y UQ10 deuterada se fragmentaron mediante disociación por colisión de alta energía con una energía de colisión de 20 en modo positivo. Las transiciones MS/MS para UQ9 y UQ10 deuterado son 812.66/197.08 y 889.77/206.18. Se generaron curvas estándar para UQ9 y UQ10 deuterado. Las cantidades de UQ9 y UQ10 deuterado en las muestras se calcularon basándose en la curva estándar.

Para generar curvas de crecimiento, las células bacterianas en BHI (con KNO3 50 mM) primero se cultivaron aeróbicamente hasta la fase logarítmica (OD600 nm alrededor de 0,5) y luego se diluyeron a OD600 nm 0,01 con caldo BHI aeróbico o anaeróbico (con KNO3 50 mM). Se monitorizó el crecimiento aeróbico y anaeróbico de P. aeruginosa a 37 °C (con agitación) midiendo la DO600 nm.

Para experimentos de competencia a largo plazo, PA14, ΔsicX, TetR (resistencia proporcionada por mini-CTX1) PA14 y TetR ΔsicX se cultivaron hasta la fase logarítmica (OD600 nm alrededor de 0,5) en BHI (con KNO3 50 mM) antes de diluir a OD600 nm 0,4 con agua fresca. medio. PA14 y TetR ΔsicX se mezclaron en una proporción de 1:1 y se transfirieron 100 µl de mezclas celulares a 4 ml de BHI anaeróbico (con KNO3 50 mM), seguido de una incubación con agitación a 37 °C en condiciones anaeróbicas. Después de 24 h, se transfirieron 20 µl del cultivo a otro tubo que contenía 4 ml de BHI anaeróbico (con KNO3 50 mM). Luego, el cultivo se pasó consecutivamente diariamente de manera similar. La competencia entre TetR PA14 y ΔsicX se llevó a cabo de manera similar a la descrita anteriormente. Los valores de UFC de las células TetR y TetS se estimaron cultivando en placas (cada día) en PIA, así como en PIA que contenía 75 µg ml-1 de Tet.

Las estructuras secundarias de ARN se predijeron utilizando mfold26 con parámetros predeterminados. Se utilizó IntaRNA 2.0 para predecir las interacciones de emparejamiento de bases entre el ARNs SicX y el ARNm25 de ubiUVT con la configuración predeterminada, y el número mínimo de pares de bases en la región de la semilla se estableció en 7.

Las infecciones crónicas de heridas en ratones se llevaron a cabo con ratones hembra Swiss Webster (de 8 a 10 semanas de edad) esencialmente como se describió anteriormente55 con algunas modificaciones. Brevemente, se llevó a cabo una escisión de piel dorsal de espesor total en la que se administró quirúrgicamente una pequeña herida circular (con un diámetro de 1,5 cm). Después de la escisión, la herida se cubrió inmediatamente con un apósito de poliuretano semipermeable. Se inyectaron un total de 104 UFC de células de P. aeruginosa en el lecho de la herida debajo del apósito para establecer la infección. Como los vendajes son necesarios para reducir la cicatrización contráctil y minimizar la contaminación de la herida con otras bacterias, fueron monitoreados de cerca y reemplazados cuando fue necesario durante todo el curso de la infección.

Para evaluar las cargas bacterianas de la infección por WT y ΔsicX, se recogieron tejidos de heridas y bazos 10 días después de la infección o en un momento temprano si el animal se encontraba moribundo (los ratones moribundos que no se identificaron inmediatamente se excluyeron del análisis de UFC) . Los tejidos se homogeneizaron en PBS durante 45 s en tubos BeadBug con perlas de acero de 2,8 mm (Sigma-Aldrich) utilizando un Mini-Beadbeater-16 (BioSpec Products). Para enumerar las UFC, las muestras homogeneizadas se diluyeron en serie y se colocaron en placas PIA. Para estudiar los resultados de diseminación de la infección por WT, ΔsicX, ΔubiUVT y ΔsicX-ubiC (Fig. 3e), 10 días después de la infección, se recolectaron órganos distales, incluidos bazos, hígados y vesículas biliares, para evaluar la presencia o ausencia de células de P. aeruginosa. . Para estudiar la organización a macroescala de la infección por P. aeruginosa, se extirpó la herida 4 días después de la infección y se utilizó una punción de biopsia de 10 mm de diámetro (Acu-Punch, Thermo Fisher Scientific) para separar el borde (aproximadamente 0,98 cm2). y regiones centrales (aproximadamente 0,77 cm2). Luego, las UFC se normalizaron según el área de superficie con fines de comparación.

La dispersión de biopelículas in vivo se llevó a cabo con ratones hembra Swiss Webster (de 8 a 10 semanas de edad) esencialmente como se describió anteriormente con algunas modificaciones. Brevemente, la herida de escisión quirúrgica del ratón se administró como se demostró anteriormente. Se inyectaron un total de 104 UFC de células de P. aeruginosa (PAO1) en el lecho de la herida debajo del apósito para establecer la infección. A las 48 h después de la infección (después de la formación de biopelículas maduras en las heridas), las infecciones de las heridas establecidas se trataron mediante la aplicación tópica de GH o cis-DA para inducir la diseminación sistémica. Específicamente, las GH están compuestas de α-amilasa bacteriana (de Bacillus subtilis; MP Biomedicals) y celulasa fúngica (de Aspergillus niger; MP Biomedicals). Se preparó una solución de α-amilasa y celulasa al 10% (p/v) (en una combinación 1:1) disolviendo enzimas en polvo en PBS. Se diluyó cis-DA (Cayman Chemical Company) en PBS hasta una concentración final de 500 nM. Las soluciones de GH y cis-DA se prepararon inmediatamente antes de su uso. Los lechos de las heridas se irrigaron con una solución de GH o cis-DA en tres infusiones tópicas separadas con 30 minutos de tiempo de permanencia para cada una. Se aspiraron infusiones tópicas que contenían células dispersas (n = 2 animales para cada tratamiento) y se colocaron inmediatamente en RNAlater (Thermo Fisher Scientific). En animales separados, los tejidos de heridas infectados con P. aeruginosa (n = 3 animales) se extirparon cuidadosamente del tejido circundante no infectado y de la capa muscular inferior a las 48 h después de la infección (sin tratamiento con GH o cis-DA) como comparación. Los tejidos de las heridas infectadas se colocaron inmediatamente en RNAlater (Thermo Fisher Scientific).

La infección por neumonía en ratones se llevó a cabo con ratones hembra BALB/c (de 6 a 8 semanas de edad) esencialmente como se describió anteriormente56 con algunas modificaciones. Brevemente, los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de 0,2 ml de un cóctel de ketamina (25 mg ml-1) y xilazina (12 mg ml-1). Para la infección con cepas derivadas de PA14, a los ratones se les instilaron por vía intranasal aproximadamente 107 UFC (una dosis subletal) de células de P. aeruginosa (en 25 µl de PBS). Los ratones fueron sacrificados a las 48 h después de la infección. Se recogieron asépticamente pulmones y bazos completos, se pesaron y se homogeneizaron en 1 ml de PBS. Los homogeneizados de tejido se diluyeron en serie y se sembraron en PIA para el recuento de UFC. Para la infección con cepas derivadas de PAO1, se utilizaron como inóculo 5 × 107 UFC (una dosis letal) de células de P. aeruginosa y se recolectaron tejidos 24 h después de la infección.

La infección cutánea subcutánea de ratón (también conocida como modelo de absceso de ratón) se llevó a cabo con ratones hembra Swiss Webster (8 semanas de edad) esencialmente como se describió anteriormente55 con algunas modificaciones. Brevemente, se afeitó la parte interna del muslo del ratón y se eliminó el vello restante con un agente depilatorio (Nair). Se inyectó por vía subcutánea un volumen de 100 μl de aproximadamente 1 × 107 UFC de células de P. aeruginosa (PA14 o ΔsicX) en la parte interna del muslo. Los ratones fueron sacrificados a las 16 h después de la infección. Los bazos se recogieron asépticamente y se homogeneizaron en 1 ml de PBS. Los homogeneizados de tejido se diluyeron en serie y se sembraron en PIA para el recuento de UFC.

Las extracciones de ARN se llevaron a cabo esencialmente como se describió anteriormente14. Para el cultivo estático in vitro de PA14, las células primero se cultivaron como se describió anteriormente (en la sección titulada ensayo de β-galactosidasa) y se mezclaron inmediatamente con cinco volúmenes de RNAlater. Después del almacenamiento a 4 °C durante la noche, las células se sedimentaron, se resuspendieron en tampón TE libre de nucleasa (Acros Organics) que contenía 1 mg ml-1 de lisozima y se transfirieron a tubos batidores de perlas que contenían una mezcla de perlas grandes y pequeñas (2 mm). circonio y circonio/sílice de 0,1 mm, respectivamente). Para los experimentos de dispersión de biopelículas in vivo (como se describe anteriormente), los tejidos infectados se eliminaron de RNAlater, se mezclaron con tampón TE y se transfirieron a tubos de batidora de perlas. Las muestras in vitro y de tejido en TE se interrumpieron brevemente mediante homogeneización utilizando un Mini-Beadbeater-16. Luego las muestras se incubaron a 37 °C durante 30 minutos para lisar enzimáticamente las células. A continuación, se añadió 1 ml de RNA-Bee a un homogeneizado de muestra de 300 μl y las muestras se lisaron mecánicamente adicionalmente batiendo las perlas tres veces durante 30 s. Se añadió un volumen de 200 µl de cloroformo por 1 ml de RNA-Bee, y los tubos se agitaron vigorosamente durante 30 segundos y luego se incubaron en hielo durante 5 minutos. Luego, las muestras se centrifugaron a 13.000 g durante 30 minutos a 4 °C para separar las fases acuosa y orgánica. La fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga al que se añadieron 0,5 ml de isopropanol (por 1 ml de RNA-Bee) y 20 µg de acrilamida lineal. Después de una incubación durante la noche a -80 °C, las muestras se descongelaron en hielo y se centrifugaron a 13.000 g durante 30 minutos a 4 °C. Los pellets se lavaron dos veces con 1 ml de etanol al 75%, se secaron al aire durante 5 minutos y se resuspendieron en 100 µl de agua libre de RNasa. La concentración de ARN para cada muestra se determinó con un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). El ARNr se agotó utilizando un kit MICROBExpress (Thermo Fisher Scientific) para las muestras in vitro y un kit QIAseq FastSelect (QIAGEN) para muestras derivadas de ratón, seguido de precipitación con etanol. El ARN empobrecido se fragmentó durante 2 minutos con el kit del módulo de fragmentación de ARN de magnesio NEBNext y las bibliotecas de ADNc se prepararon utilizando el kit de preparación de biblioteca de ARN pequeño multiplex NEBNext (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas se secuenciaron en el Molecular Evolution Core del Instituto de Tecnología de Georgia en un Illumina NextSeq500 utilizando ejecuciones de un solo extremo de 75 pb.

Además de las bibliotecas de RNA-seq mencionadas anteriormente y preparadas en este estudio, se analizaron 202 conjuntos de datos de RNA-seq de P. aeruginosa disponibles públicamente, incluidos 28 transcriptomas de P. aeruginosa derivados de muestras humanas, 28 de modelos de infección y 146 de una variedad de condiciones in vitro bien definidas (enumeradas en la Tabla complementaria 1). La calidad de las lecturas de secuenciación sin procesar se confirmó por primera vez con FastQC v0.11.7 (ref. 57). A continuación, se recortaron las lecturas de RNA-seq en los extremos 3 'para quitar el adaptador Illumina (AGA TCG GAA GAG CAC ACG TCT GAA CTC CAG TCA C) usando Cutadapt 3.0 (ref. 58) con un umbral de longitud de lectura mínimo de 22 bases. Luego, las lecturas recortadas se asignaron al genoma de referencia PA14 de P. aeruginosa (disponible para descargar desde pseudomonas.com) utilizando Bowtie2 v2.4.2 con parámetros predeterminados para la alineación de un extremo a otro59. Como PA1414 (sicX) se anotó originalmente como un gen codificador de proteínas, primero asignamos lecturas a genes codificadores de proteínas con featureCounts Subread v2.0.1 (ref. 60; resultados mostrados en la Fig. 1a). Para los análisis restantes (Figs. 1b, 2a y 4b-d y Datos extendidos Figs. 2b y 10), se contaron las lecturas asignadas a ambos genes codificadores de proteínas, así como a 199 sRNA15.

La expresión diferencial se determinó con DESeq2 (Figs. 1a y 4b-d; ref. 61). Para comparar los niveles de expresión sicX en diferentes muestras (Fig. 1a y Datos extendidos Fig. 5), las lecturas sin procesar se normalizaron utilizando la función varianceStabilizingTransformation() en el paquete DESeq2. Para estimar la abundancia relativa de transcripción de diversas características (genes codificadores de proteínas, sRNA, sicX y/o rsmYZ), calculamos TPM. Primero, los recuentos brutos se normalizaron según la longitud de la característica (gen) para generar lecturas por kilobase (RPK). A continuación, se contaron todos los valores de RPK y se dividieron por 1.000.000 para determinar el factor de escala. Finalmente, la RPK de cada gen se dividió por el factor de escala. Los valores de TPM resultantes se usaron para hacer las Figs. 1b y 2a y datos ampliados Figs. 2b y 10. Para examinar el patrón de alineación de las lecturas de sicX, se utilizó samtools v1.13 para medir la profundidad de lectura que abarca el locus sicX en cada posición de nucleótido62. Luego, la profundidad de lectura se normalizó utilizando la función estimaSizeFactors() en DESeq2 antes de trazar.

Se construyó un árbol filogenético de máxima verosimilitud en PhyML 3.0 (ref. 63) utilizando 365 secuencias de ARNr 16S que representan diversos aislados de Pseudomonas. Para una mejor visualización del árbol, incluimos solo aproximadamente 50 secuencias 16S de las cepas de P. aeruginosa. Las secuencias 16S se alinearon con MUSCLE y se utilizaron como entrada en PhyML 3.0. Los modelos evolutivos que mejor se ajustan se predijeron con el criterio de información de Akaike corregido. El árbol fue visualizado y anotado en iTOL64.

El análisis de enriquecimiento de ontología genética se realizó utilizando Galaxy v2.0.1. Los genes expresados ​​diferencialmente en respuesta al tratamiento con GH o cis-DA se analizaron utilizando el archivo Gene Ontology (obtenido de http://geneontology.org/docs/download-ontology) y las anotaciones de términos de P. aeruginosa PAO1 Gene Ontology (obtenidas de https //pseudomonas.com/goterms/list). Se realizó una prueba de Benjamini-Hochberg con un valor de corte de P <0,05.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de forma independiente al menos tres veces (a menos que se indique lo contrario en las leyendas de las figuras) con observaciones similares. Los valores exactos de n para estudios con animales y experimentos in vitro se proporcionan en las figuras y leyendas. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism GraphPad 9 y se especifican en las leyendas de las figuras. Para la transferencia Northern, cada experimento se realizó al menos dos veces de forma independiente (utilizando muestras de ARN recién extraídas) con observaciones similares y se muestran imágenes representativas.

Todos los procedimientos con ratones se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los animales fueron tratados humanamente y alojados en instalaciones con temperatura y humedad controladas (18–22 °C; 40–50%) con ciclos de luz y oscuridad de 12 h. El protocolo para la infección crónica de heridas en ratones fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Tecnológica de Texas (número de protocolo 07044) y por el IACUC del Instituto de Tecnología de Georgia (número de protocolo A100127). El protocolo para el modelo de infección subcutánea en ratón fue aprobado por el IACUC del Instituto de Tecnología de Georgia (número de protocolo A100127). Para el modelo de infección por neumonía en ratones, todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las pautas de la IACUC de la Universidad Emory, bajo el protocolo aprobado número DAR-201700441.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos de proteómica generados en este estudio se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset), con los números de acceso PXD032985 y PXD032986. Las lecturas sin procesar de nuestros estudios de RNA-seq se han depositado en Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) con los números de BioProject PRJNA934328 y PRJNA904394. Los 202 transcriptomas de P. aeruginosa disponibles públicamente analizados en este estudio se resumen en la Tabla complementaria 1 y se pueden obtener en Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) con el número de acceso correspondiente. . El genoma de referencia PA14 de P. aeruginosa (acceso a BioSample SAMN02603591) está disponible para descargar desde https://pseudomonas.com. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a D. Cornforth y otros miembros del laboratorio de MW por su útil discusión sobre el manuscrito y su ayuda con los experimentos con animales. Agradecemos a G. Welch y H. Hui por su ayuda con los experimentos con animales. Agradecemos a S. Brown, S. Diggle y C. Baskett por la lectura crítica del manuscrito. Los estudios proteómicos y metabolómicos contaron con el apoyo del Centro Central de Espectrometría de Masas de Sistemas Tecnológicos de Georgia, así como del Centro de Proteómica de Cambridge. Este estudio fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R21AI154220 (a MW), R21AI137462 (a KPR) y R21AI147178 (a CSS), las subvenciones de la Cystic Fibrosis Foundation WHITEL20A0 y WHITEL22G0 (a MW) y la Cystic Fibrosis Trust Foundation SRC017 (a MW). PC y SKD cuentan con el apoyo de las becas posdoctorales en fibrosis quística CAO20F0 y DOLAN20F0, respectivamente.

Derek Fleming

Dirección actual: División de Microbiología Clínica, Departamento de Medicina y Patología de Laboratorio, Mayo Clinic, Rochester, MN, EE. UU.

Whitni K. Redman

Dirección actual: Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Binghamton, Binghamton, Nueva York, EE. UU.

Estos autores contribuyeron igualmente: Stephen K. Dolan, Kayla H. Szymanik

Facultad de Ciencias Biológicas, Instituto de Tecnología de Georgia, Atlanta, GA, EE. UU.

Pengbo Cao, Stephen K. Dolan, Anayancy Ramos, Frances L. Diggle y Marvin Whiteley

Centro de Fibrosis Quística Emory-Children's, Atlanta, GA, EE. UU.

Pengbo Cao, Dina A. Moustafa, Stephen K. Dolan, Anayancy Ramos, Frances L. Diggle, Joanna B. Goldberg y Marvin Whiteley

Centro de Infección y Dinámica Microbiana, Instituto de Tecnología de Georgia, Atlanta, GA, EE. UU.

Pengbo Cao, Stephen K. Dolan, Anayancy Ramos, Frances L. Diggle y Marvin Whiteley

Departamento de Cirugía, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Tecnológica de Texas, Lubbock, TX, EE. UU.

Derek Fleming, Whitney K. Redman y Kendra P. Rumbaugh

Departamento de Inmunología y Microbiología Molecular, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Tecnológica de Texas, Lubbock, TX, EE. UU.

Derek Fleming, Whitney K. Redman y Kendra P. Rumbaugh

Centro de Excelencia en Investigación de Quemaduras, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Tecnológica de Texas, Lubbock, TX, EE. UU.

Derek Fleming, Whitney K. Redman y Kendra P. Rumbaugh

Departamento de Pediatría, División de Pulmonar, Asma, Fibrosis Quística y Sueño, Facultad de Medicina de la Universidad Emory, Atlanta, GA, EE. UU.

Dina A. Moustafa y Joanna B. Goldberg

Departamento de Biociencias Moleculares, Universidad de Texas en Austin, Austin, TX, EE. UU.

Kayla H. Szymanik y Christopher S. Sullivan

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PC y MW concibieron y diseñaron el estudio, analizaron datos y escribieron el manuscrito; DF, DAM, PC, WKR y FLD contribuyeron a varios aspectos de los experimentos con animales; SKD preparó muestras y realizó análisis de datos para proteómica; KHS llevó a cabo análisis y transferencias Northern; PC, MW y AR construyeron cepas bacterianas y llevaron a cabo ensayos indicadores; PC llevó a cabo todos los demás experimentos y análisis de datos; CSS, JBG y KPR proporcionaron orientación técnica y analizaron datos.

Correspondencia a Marvin Whiteley.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

El árbol de máxima probabilidad se construye con secuencias de ADNr 16s de cepas representativas del género Pseudomonas. Los grupos de especies abundantes se indican con cuadros de colores. Se destacan las cepas que, según se informó, fueron aisladas de entornos humanos u hospitalarios.

a. Esquema de mutagénesis del motivo de unión a Anr. b. Figura 2a con la adición de cinco transcriptomas de crecimiento estático in vitro (círculos azules; las bibliotecas de RNA-seq se prepararon siguiendo el mismo método utilizado en nuestro estudio de transcriptomas de P. aeruginosa en humanos). C. Crecimiento planctónico (OD600) de WT y ΔPA1414 en presencia o ausencia de oxígeno. Se muestran los valores medios de 3 experimentos independientes. d. Lecturas de RNA-seq alineadas con el locus PA1414 (sicX) durante el crecimiento aeróbico y anaeróbico in vitro. mi. Crecimiento de biopelículas de colonias de ΔsicX que albergan diferentes mutaciones sicX (como se ilustra en la Fig. 2g) en condiciones aeróbicas. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. n = 4 experimentos independientes. Se realizó la prueba de Mann-Whitney de dos colas que compara WT y entre sí (ns, no significativo). F. Análisis de transferencia Northern en diferentes alelos sicX como se muestra en la figura 2g. La abundancia de sRNA se estimó primero normalizándola con respecto al rRNA 5S (control de carga) y luego comparándola con el nivel WT. La aptitud del crecimiento anaeróbico se indicó con + (sin defecto) y - (defecto). Para obtener datos de la fuente del gel, consulte la figura complementaria 1.

a. Emparejamiento de bases previsto entre el ARNm de SicX y ubiUVT. Los nucleótidos resaltados en negrita estaban sujetos a mutaciones puntuales (A → U, U → A, G → C, C → G), que se evaluaron mediante el informador traduccional ubiUVT-lacZ. Se evaluaron las actividades de β-galactosidasa en las biopelículas de colonias cultivadas en condiciones anaeróbicas como se describe46. El mapa de calor muestra los valores medios. Los nucleótidos sujetos a cambios de base compensatorios se resaltan con bordes magenta. Las regiones de emparejamiento de bases previstas se resaltan con bordes discontinuos. b. Las actividades de β-galactosidasa (valores individuales) del experimento mostrado en (A) se cuantificaron como se describe46. Las posibles mutaciones compensatorias están resaltadas en azul. Las líneas discontinuas verdes indican las actividades medias de β-galactosidasa en WT y ΔsicX. AU, unidad arbitraria. n = 5 experimentos independientes. C. Ensayos de β-galactosidasa que evalúan si las mutaciones 5'UTR pueden alterar la traducción de ubiUVT independientemente de SicX durante el crecimiento estático. También se evaluaron mediante este ensayo WT y ΔsicX que albergan el indicador ubiUVT-lacZ (crecido como biopelículas de colonias anaeróbicas). n ≥ 3 experimentos independientes. d. Ensayos de β-galactosidasa que indican que la presencia o ausencia de Hfq no afecta la inducción de la traducción de ubiUVT por SicX. n ≥ 5 experimentos independientes. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. Se realizó la prueba de Mann-Whitney de dos colas para b – c (ns, no significativo).

a. El porcentaje de identidad de 258 ortólogos ubiUVT (en comparación con el alelo ubiUVT de PA14) en la escala de un solo nucleótido. Se resalta el sitio de unión de sicX en la UTR 5'. b. Alineamiento de la secuencia de ADN de la región intergénica aguas arriba de 258 ortólogos de ubiUVT. C. Alineamiento de la secuencia de ADN de 258 ortólogos sicX (solo se muestra la región de ARNs). Se indican la región semilla en SicX y la región objetivo en la UTR 5' de ubiUVT.

a. Lecturas de RNA-seq alineadas con el locus PA1414 (sicX) en la infección crónica de heridas en ratones. b. El nivel de ARN sicX en la herida crónica del ratón es comparable al de los humanos. Las líneas indican medios. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney de dos colas para comparar las cargas bacterianas (ns, no significativa). C. Cargas bacterianas en la herida (información de difusión mostrada en la Fig. 3e). Las líneas indican medios. n = 9 animales (para cada grupo) en tres experimentos independientes. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney de dos colas para comparar las cargas bacterianas de WT y de cada otro mutante (ns, no significativo).

Datos fuente

Se inyectaron por vía subcutánea células de P. aeruginosa (~107 UFC) en la parte interna del muslo del ratón para inducir una infección sistémica. La carga bacteriana en el bazo se evaluó 16 h después de la infección. PESO (n = 7) y ΔsicX (n = 8). Las líneas indican medios. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney de dos colas.

Datos fuente

a. Esquema de mutagénesis en la UTR 5' de ubiUVT: el sitio de unión de SicX, el sitio de unión del ribosoma y el codón de inicio están coloreados de manera diferente; se resalta la estructura de vástago-bucle; La mutagénesis (ubiC) se indica con una flecha. b. Restaurando la traducción ubiUVT en ΔsicX. Se realizó un ensayo de β-galactosidasa para evaluar la actividad traslacional de ubiUVT con y sin mutación 5'UTR como se describe en A (n = 6). cd. Rendimiento de crecimiento de biopelículas de colonias en presencia o ausencia de oxígeno (n = 4). Las barras de error representan la desviación estándar de la media. Las diferencias significativas (en comparación con el WT) se indican con asteriscos (*, P <0,05; **, P <0,01; prueba de Mann-Whitney de dos colas).

a. Esquema del experimento de infección por neumonía en ratones. b. Carga de P. aeruginosa en el pulmón. Las líneas indican medios. C. Carga de P. aeruginosa en el bazo. Las líneas indican medios. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney de dos colas para comparar las cargas bacterianas. Resumen de dos réplicas biológicas para b y c.

Datos fuente

Los términos de Gene Ontology (GO) están etiquetados a la izquierda. Se realizó la prueba exacta de Fisher de una cola. Abajo, regulado a la baja; arriba, regulado al alza.

a. Esquemas de la cascada Gac-Rsm en P. aeruginosa. Los componentes que promueven estilos de vida de biopelículas (verde) y planctónicos (azul) están codificados por colores. b. Abundancia relativa de transcripción (TPM, transcripciones por millón) de sicX en comparación con todas las secuencias codificantes de proteínas (CDS), sRNA de rsmYZ y los sRNA no codificantes restantes en 202 transcriptomas examinados en la Fig. 2a. Los transcriptomas se ordenan del TPM sicX más alto al más bajo. C. Un mapa de calor que muestra el TPM medio de CDS, sRNA, rsmYZ y sicX en transcriptomas de P. aeruginosa. d. Ensayos de β-galactosidasa que demuestran que la expresión de sicX es independiente de GacS-GacA. PsicX-lacZ, lacZ fusionado transcripcionalmente al promotor sicX. MrT7, transposón MAR2xT7. n = 4 en todos los experimentos. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. La diferencia significativa (en comparación con WT) se analizó con una prueba de Mann-Whitney de dos colas (ns, no significativa).

Este archivo contiene la Figura 1 complementaria, las Tablas 1 a 3 y las referencias.

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Reimpresiones y permisos

Cao, P., Fleming, D., Moustafa, DA et al. Un ARN pequeño de Pseudomonas aeruginosa regula la infección crónica y aguda. Naturaleza 618, 358–364 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06111-7

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Recibido: 26 de octubre de 2022

Aceptado: 21 de abril de 2023

Publicado: 24 de mayo de 2023

Fecha de emisión: 08 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06111-7

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