Distribución de aguas termales y mecanismos de supervivencia del comammox termófilo Nitrospira.

The ISME Journal volumen 17, páginas 993–1003 (2023)Cite este artículo

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El reciente descubrimiento de especies de Nitrospira capaces de oxidar completamente el amoníaco (comammox) en ecosistemas naturales y artificiales no marinos en condiciones mesotérmicas ha cambiado nuestra comprensión de la nitrificación microbiana. Sin embargo, se sabe poco sobre la aparición de bacterias comammox o su capacidad para sobrevivir en hábitats moderadamente térmicos y/o hipertermales. Aquí, informamos la amplia distribución de comammox Nitrospira en cinco aguas termales terrestres a temperaturas que oscilan entre 36 y 80 ° C y proporcionamos genomas ensamblados en metagenomas de 11 nuevas cepas de comammox. Curiosamente, la identificación de la reducción disimilatoria de nitrato a amonio (DNRA) en los linajes termófilos de comammox Nitrospira sugiere que tienen funciones ecológicas versátiles como sumideros y fuentes de amoníaco, en contraste con los linajes mesófilos de comammox descritos, que carecen de la vía DNRA. Además, la expresión in situ de genes clave asociados con el metabolismo del nitrógeno, la adaptación térmica y el estrés oxidativo confirmó su capacidad para sobrevivir en las aguas termales estudiadas y su contribución a la nitrificación en estos ambientes. Además, el tamaño del genoma más pequeño y el mayor contenido de GC, los aminoácidos menos polares y más cargados en los perfiles de uso y la expresión de una gran cantidad de proteínas de choque térmico en comparación con las cepas mesófilas de comammox presumiblemente confieren tolerancia al estrés térmico. Estos nuevos conocimientos sobre la aparición, la actividad metabólica y la adaptación de comammox Nitrospira en hábitats térmicos amplían aún más nuestra comprensión de la distribución global de comammox Nitrospira y tienen implicaciones significativas sobre cómo estos microorganismos únicos han desarrollado estrategias de tolerancia térmica.

Durante el siglo pasado, se creía que la nitrificación quimiolitoautotrófica era un proceso de dos pasos llevado a cabo por un consorcio de microorganismos. Sin embargo, este paradigma ha cambiado radicalmente gracias a los descubrimientos que hicieron época de organismos individuales capaces de oxidar el amoníaco a nitrato [1, 2]. Estas bacterias quimiolitoautótrofas que oxidan completamente el amoníaco (comammox) pertenecen al sublinaje II del género Nitrospira, de ramificación profunda, que anteriormente se consideraba que solo realizaba oxidación de nitritos [3]. Si bien se han realizado intentos para caracterizar completamente el comammox Nitrospira, actualmente solo se ha obtenido una cepa aislada y un número limitado de cultivos de enriquecimiento [4,5,6,7]. De dos de estos cultivos de comammox Nitrospira, la caracterización cinética sugiere que tienen una alta afinidad por el amoníaco y prefieren habitar ambientes oligotróficos [4, 5]. Por lo tanto, los ecosistemas con flujo de nutrientes limitado favorecen la presencia de comammox Nitrospira, que incluso puede dominar sobre los oxidantes de amoníaco canónicos [por ejemplo, las bacterias oxidantes de amoníaco (AOB)]. Sin embargo, los estudios de campo han sugerido que otros factores además de la disponibilidad de amoníaco también desempeñarán un papel en la diferenciación de nicho de los oxidantes de amoníaco [8, 9].

La importancia ecológica del comammox Nitrospira sólo se ha descifrado parcialmente, aunque se ha descubierto que está ampliamente distribuido en ecosistemas naturales y artificiales no marinos. Los entornos donde se han detectado incluyen suelos, entornos naturales de agua dulce, instalaciones de tratamiento de aguas residuales y sistemas de producción y distribución de agua potable [10,11,12,13,14,15,16,17,18]. A excepción de la primera y hasta ahora única cepa de comammox, Nitrospira inopinata, que se tomó originalmente de una tubería de agua caliente (56 °C) y se cultivó en condiciones térmicas moderadas de 46 a 50 °C [1, 4], todos los demás estudios fueron asociado con condiciones mesotérmicas. Esto plantea la pregunta sobre el papel que desempeña el comammox Nitrospira en el ciclo del nitrógeno en hábitats térmicos e hipertermales.

Los hábitats geotérmicos como los respiraderos hidrotermales submarinos y las aguas termales terrestres albergan una variedad de microorganismos quimiolitoautótrofos, posiblemente desde el origen de la vida celular [19,20,21]. Las investigaciones de las comunidades microbianas de aguas termales se remontan al siglo XIX [22], mientras que la comprensión de su diversidad y capacidad metabólica ha mejorado significativamente en las últimas dos décadas debido a los avances en las tecnologías de secuenciación. Un compuesto de las aguas termales que es de particular interés es el amonio, que es el principal compuesto nitrogenado observado en los hábitats geotérmicos [23]. En consecuencia, las arqueas aerobias termófilas oxidantes de amoníaco (AOA) se han encontrado ampliamente en ecosistemas térmicos [24,25,26,27]. Además, se han identificado bacterias oxidantes de nitritos (NOB) afiliadas al género Nitrospira o al filo Chloroflexi en aguas termales geotérmicas [28,29,30]. La posibilidad de que los miembros del género Nitrospira, incluida la especie comammox N. inopinata, toleren el estrés inducido térmicamente indica que también el comammox Nitrospira puede proliferar en ecosistemas de alta temperatura, pero hasta la fecha no se ha realizado ningún informe de ese tipo para los manantiales geotérmicos naturales. Esto lleva a preguntas sobre cuán ampliamente distribuida está la comammox Nitrospira termófila, qué estrategias emplean estas especies para protegerse del estrés por calor y si existen diferencias genómicas entre la comammox Nitrospira en hábitats térmicos y no térmicos.

Aquí, informamos la aparición y actividad de comammox Nitrospira en ecosistemas terrestres de aguas termales, exploramos sus posibles mecanismos de supervivencia en condiciones (hiper) térmicas y comparamos las características genómicas de comammox Nitrospira obtenidas de hábitats térmicos y no térmicos. Estos nuevos conocimientos sobre la aparición, actividad y adaptación de comammox Nitrospira en hábitats térmicos amplían aún más nuestra comprensión de la distribución global de estos microorganismos únicos y proporcionan información importante sobre las estrategias de defensa microbiana contra el estrés por calor.

Se recogieron un total de 10 muestras de biomasa para la extracción de ADN de los sedimentos superficiales (~5 cm superiores) de cinco fuentes termales JinZe (JZ), ShuiReBaoZha (SRBZ) y ShiZiTouDuiMian (SZTDM) ubicadas en el condado de Tengchong en la provincia de Yunnan, y DaGeJia. (DGJ) y QuZhuoMu (QZM) ubicados cerca de la ciudad de Rikaze en el Tíbet, China. Todas las muestras de aguas termales se encuentran en altitudes de ≥ 4000 m sobre el nivel del mar. Al momento del muestreo, estas aguas termales abarcaban una amplia gama de parámetros fisicoquímicos con temperaturas y pH que oscilaban entre 36,7 y 80,0 °C y 3,0 a 8,2, respectivamente. Las ubicaciones de las muestras, las fechas de muestreo y los parámetros fisicoquímicos se resumen en la Tabla complementaria S1. Los métodos detallados para la recolección de muestras, análisis químicos, extracción de ADN y secuenciación metagenómica se describen en un estudio previo [31].

Las lecturas metagenómicas sin procesar se generaron utilizando un instrumento Hiseq 4000 (Illumina, EE. UU.) y se obtuvieron lecturas de alta calidad de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente [32]. Las lecturas filtradas se ensamblaron posteriormente utilizando SPAdes v3.10.1 [33] con las siguientes opciones: −k 21,33,55,77,99,111 –meta. Se incluyeron contigs con una longitud> 2500 pb para la agrupación del genoma según la frecuencia de los tetranucleótidos y la profundidad de secuenciación utilizando MetaBAT v2.12.1 [34]. Para calcular la profundidad de secuenciación, las lecturas filtradas se asignaron a contigs ensamblados utilizando BBMap v38.85 con una configuración de identidad mínima de 0,97. Se realizó el comando "jgi_summarize_bam_contig_ Depths" en MetaBAT para generar la tabla de profundidad de secuenciación. Los contenedores genómicos se visualizaron utilizando mapas autoorganizados emergentes (ESOM) [35]. La integridad, la contaminación y la heterogeneidad de las cepas de cada genoma ensamblado en metagenoma (MAG) se estimaron utilizando CheckM v1.0.5 [36]. Para reducir la contaminación y la heterogeneidad, todos los MAG se examinaron manualmente para eliminar los contigs con cobertura anormal o posiciones discordantes dentro del ESOM. Finalmente, se reclutaron lecturas limpias de cada MAG usando BBMap y se reensamblaron usando SPAdes v3.9.0 con parámetros: −k 21,33,55,77,99,127 –cuidado.

La asignación taxonómica de los MAG obtenidos se realizó utilizando GTDB-tk v1.7.0 [37]. La identidad de aminoácidos promedio (AAI) por pares entre MAG y genomas de referencia seleccionados se calculó como se describió anteriormente [38]. La abundancia relativa de los MAG recuperados se calculó utilizando información de cobertura dividiendo la suma de las coberturas de todos los contigs pertenecientes al MAG respectivo por la suma de las coberturas de todos los contigs, multiplicada por 100. Comparar la abundancia relativa de comammox Nitrospira con otras poblaciones como las bacterias AOB, AOA y anammox, se tomaron en consideración los MAG con la posesión de cualquiera de los siguientes genes: amoniaco monooxigenasa (amoCAB), hidroxilamina deshidrogenasa (hao), nitrito reductasa formadora de NO (nirS o nirK), hidracina sintasa. (hzs), hidrazina deshidrogenasa (hdh) y nitrito oxidorreductasa (nxrAB).

Las secuencias codificantes de proteínas (CDS) se predijeron utilizando Prodigal v2.6.3 [39]. La anotación funcional y la reconstrucción de la vía metabólica se realizaron mediante la búsqueda del CDS predicho en bases de datos que incluyen NCBI no redundante (nr), genealogía evolutiva de genes: grupos ortólogos no supervisados (eggNOG), enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) y carbohidratos. -EnZimas activas (CAZy) usando DIAMOND v0.7.9 con un valor de corte E de <1e-5 [40]. Las supuestas hidrogenasas pertenecientes a PF00374 y PF02906 se identificaron mediante una búsqueda en la base de datos de Pfam utilizando el comando "hmmscan" en HMMer v3.3.2 [41]. Las secuencias de aminoácidos de supuestas hidrogenasas se cargaron en la herramienta web HydDB (https://services.birc.au.dk/hyddb/) para determinar la clasificación de subtipos y predecir posibles funciones. El uso de aminoácidos y el índice IVYWREL para cada MAG se calcularon utilizando scripts Perl personalizados (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22220173). Las hélices transmembrana en proteínas se predijeron utilizando la herramienta en línea TMHMM-2.0 (//services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0). El punto isoeléctrico (pI) de cada proteína se calculó utilizando la herramienta en línea IPC v2.0 (http://isoelectric.org/index.html).

Para comprender las relaciones filogenómicas del comammox Nitrospira de aguas termales, se recuperó un conjunto de 120 genes marcadores conservados de 131 genomas representativos de Nitrospira de la base de datos NCBI Refseq (Conjunto de datos complementario 1). Las secuencias extraídas se alinearon usando MUSCLE v3.8.31 [42], y las regiones mal alineadas se eliminaron usando TrimAl v1.4.rev22 [43]. El árbol filogenómico se generó utilizando IQ-TREE v1.6.10 [44] con arranque ultrarrápido (-bb 1000), así como una prueba de índice de probabilidad aproximada similar a Shimodaira-Hasegawa (SH-aLRT, -alrt 1000). El mejor modelo del árbol fue LG + F + R6, según lo determinado por ModelFinder [45], y estaba bien respaldado por el Criterio de Información Bayesiano.

Para las proteínas funcionales (AmoCAB, NxrAB y los diferentes tipos de hidrogenasa), se alinearon y filtraron las secuencias de aminoácidos. Las filogenias se construyeron con los mismos procedimientos descritos anteriormente. Los mejores modelos para las filogenias basadas en AmoCAB, NxrAB y hidrogenasa (basadas en las subunidades grandes) fueron LG + F + R4, LG + F + G4 y LG + R9, respectivamente. Todos estos modelos estaban bien respaldados por el criterio de información bayesiano. Los árboles de máxima verosimilitud generados se visualizaron utilizando iTOL v6 (https://itol.embl.de).

Se exploró la actividad metabólica in situ de comammox Nitrospira en aguas termales mediante secuenciación metatranscriptómica para determinar cuáles de sus genes se expresaban activamente. Debido a las dificultades para preservar el ARN de calidad suficiente en estos ambientes térmicos extremos, el ARN se extrajo con éxito solo de una muestra de QiaoQuan (QQ) en julio de 2022 y de dos muestras de JinZe (JZ-2 y JZ-4) en enero de 2021 ( Tabla complementaria S1). El ARN total se extrajo utilizando el kit RNeasy PowerSoil Total RNA (QIAGEN) y se generaron entre 20 y 30 Gbps de datos de secuencia sin procesar utilizando un instrumento HiSeq 4000 en Guangdong Magigene Biotechnology Co., Ltd. (Guangzhou, China). La calidad de las lecturas sin procesar se controló utilizando Sickle v1.33 (https://github.com/najoshi/sickle) con los parámetros -t sanger –quiet -l 50. Siete de los 11 MAG comammox de aguas termales se seleccionaron manualmente como genomas de referencia de acuerdo con a AAI ≥ 95% en todo el nivel del genoma (Tabla complementaria S2). Las lecturas limpias se asignaron a genomas de referencia utilizando BBMap v35.85 con los mismos parámetros que los anteriores. Las interconversiones entre los formatos de archivo.bam y.bed se llevaron a cabo utilizando SAMTools v1.3.1 [46] y BEDTools v2.30.0 [47]. Los niveles de expresión génica en fragmentos por kilobase de transcripción por millón de fragmentos mapeados (FPKM) se calcularon utilizando Cufflinks v2.2.1 [48] para cada muestra.

Se generaron diez metagenomas a partir de muestras de sedimentos recolectadas de cinco fuentes termales ubicadas en Tengchong (provincia de Yunnan) y Angren (Región Autónoma del Tíbet), China (Tabla complementaria S1). Las temperaturas en los lugares de muestreo oscilaron entre 36,7 y 80,0 °C, mientras que el pH varió entre 3,0 y 8,2. Las concentraciones de amonio en los sedimentos examinados fueron en su mayoría inferiores a 10 mg N/kg (0,7 mmol/kg), excepto la muestra tomada de las aguas termales de ShiZiTouDuiMian (16,3 mg N/kg, 1,2 mmol/kg).

Se reconstruyeron con éxito un total de 11 MAG comammox Nitrospira (Tabla 1 y Tabla complementaria S2). Específicamente, se ensamblaron cuatro MAG comammox Nitrospira de dos ubicaciones diferentes en las aguas termales de JinZe (llamadas JZ-3 y JZ-4), dos de DaGeJia (DGJ01_4 y DGJ02_3), dos de ShuiReBaoZha (SRBZ-2), dos de QuZhuoMu (QZM_B4_2 y QZM_B4_3), y uno de ShiZiTouDuiMian (SZTDM-2). Estos 11 MAG comammox Nitrospira de alta calidad varían en tamaño de 2,46 a 2,95 Mbp con estimaciones de integridad > 88 % y valores de contaminación < 3 % (Tabla 1). Para el comammox Nitrospira DGJ01_4_Bin137 y DGJ02_3_Bin65, estos MAG eran muy similares entre sí (99,8% AAI), pero provenían de aguas termales con ambientes dispares en términos de parámetros de pH y temperatura (Tabla complementaria S1). Los patrones de expresión genética para DGJ02_3_Bin65 en tres muestras con un pH de 6,8 a 8,6 y una temperatura de 27 a 70 °C (ver más abajo) indicaron que estas dos cepas eran activas en ambientes neutros a ligeramente alcalinos en un amplio rango de temperatura. Aún no está claro si también pueden sobrevivir en condiciones ácidas y sólo puede verificarse mediante experimentos basados en cultivos.

En estos ambientes de aguas termales, los MAG de comammox Nitrospira representaron los organismos oxidantes de amoníaco dominantes (0,01 a 1,28% de abundancia relativa en comparación con todas las bacterias y arqueas detectadas en metagenomas) en ocho de cada diez muestras, excepto las muestras JZ-4_201709 (38,0 ° C) y SZTDM-2_201709 (54,0 °C), en los que AOB y AOA mostraron una mayor abundancia relativa, respectivamente (Fig. 1a). Además, también se encontraron NOB presentes en siete muestras con abundancias relativas de 0,24 a 0,96%. El análisis filogenómico reveló que los 11 MAG de comammox formaron dos subclados dentro del clado A de comammox Nitrospira (Fig. 1b), con ocho MAG en un grupo con N. inopinata y los tres restantes formaron un linaje hermano adyacente. Esta agrupación con N. inopinata mostró que todas las cepas termófilas actualmente conocidas dentro del clado A comammox Nitrospira están estrechamente relacionadas entre sí. Estos resultados indican que la tolerancia térmica del comammox Nitrospira de aguas termales probablemente se hereda de su último ancestro común dentro del clado A, que adquirió la tolerancia térmica después de mudarse a hábitats térmicos. Sin embargo, no se puede descartar la existencia de otras cepas de comammox termófilas que sean divergentes de este grupo.

a Abundancias relativas inferidas de comammox Nitrospira y AOB MAG en aguas termales analizadas. b Afiliaciones filogenómicas de COMMMOX Nitrospira MAG en relación con organismos de referencia seleccionados. El árbol de máxima probabilidad se construyó utilizando 120 proteínas marcadoras de un total de 142 genomas (ver Métodos). Se utilizaron genomas de Thermotogae como grupo externo. El linaje I y el linaje II de Nitrospira están resaltados con cuadros azules y morados, respectivamente. Los números entre paréntesis en los linajes colapsados indican el número de genomas/MAG por grupo. Los clados A y B de Comammox Nitrospira se indican con fondos verdes y amarillos, respectivamente. Los identificadores de COMMMOX Nitrospira MAG obtenidos en el presente estudio se muestran en rojo. Los valores de Bootstrap (basados en 1000 iteraciones) ≥70 y ≥90 se indican mediante círculos grises y negros, respectivamente. El tamaño del genoma y el contenido de GC de cada genoma de Nitrospira se muestran en el lado izquierdo y los MAG de este estudio se indican con barras rellenas. Los hábitats de origen de los genomas/MAG se resumen en el lado derecho del árbol: ETAP, planta de tratamiento de agua potable; EDAR, planta de tratamiento de aguas residuales; RAS, sistema de recirculación de acuicultura.

De acuerdo con su posición filogenética dentro del clado A de comammox Nitrospira y confirmando un estilo de vida tipo comammox, se encontró que los 11 MAG de aguas termales contenían genes de amoníaco monooxigenasa (amoCAB), hidroxilamina deshidrogenasa (hao) y nitrito oxidorreductasa (nxrAB), que son requerido para la oxidación completa del amoníaco a nitrato (Fig. 2). AmoCAB y nxrAB en cada MAG se co-localizaron en andamios contiguos y formaron clados monofiléticos con N. inopinata en análisis filogenéticos (Figura complementaria S1). Si bien se reconoce la limitación dada por los MAG incompletos, hay una ausencia notable de transportadores de amoníaco (Rh50 y amt) en casi todos los MAG Nitrospira comammox de aguas termales, excepto JZ-3_Bin7, a pesar de su presumible dependencia del amoníaco para los procesos de asimilación. A pesar de no ser detectada, la urea es un metabolito intracelular general de procariotas y eucariotas y también se libera durante la remineralización de la materia orgánica [49]. Se observó un complemento completo de genes para la utilización de urea en los 11 MAG Nitrospira comammox de aguas termales (Fig. 2, Fig. Suplementaria S2) [1, 4, 6], y el amoníaco generado a partir de la hidrólisis de urea intracelular puede potencialmente apoyar el crecimiento de comammox Nitrospira de aguas termales en ambientes con limitación de amonio. De manera análoga a otros genomas de comammox informados, el comammox Nitrospira de aguas termales también carece de una nitrito reductasa asimiladora, lo que sugiere su incapacidad para crecer con nitrito o nitrato como única fuente de nitrógeno.

Se muestran vías y genes implicados en el metabolismo del carbono, hidrógeno, nitrógeno y azufre, así como en la respiración, el transporte de electrones y la defensa contra el estrés. Los módulos metabólicos se indican mediante distintos esquemas de color. La presencia de tipos de metabolismo en 11 MAG de Nitrospira comammox de aguas termales de este estudio se indica de la siguiente manera: los círculos sólidos de color azul oscuro representan los 11 MAG; los círculos sólidos de color azul claro representan de 5 a 10 MAG; los círculos huecos de color azul claro representan de 1 a 4 MAG; y los círculos grises sólidos representan 0 MAG. El esquema de numeración asociado con las vías mostradas se proporciona en el Conjunto de datos complementario 2. Los complejos de la cadena respiratoria están etiquetados con números romanos. Abreviaturas: 2-Oxo 2-Oxo-glutarato, APS adenosina 5′-fosfosulfato, Arg arginina, Car-P carbamoil-P, Citrato de Cit, Citr citrulina, Cys cisteína, subunidad grande relacionada con la hidrogenasa convertidora de energía de EhrL, fumarato de Fum, HydG [NiFe]-hidrogenasas del grupo 3b, isocitrato de iso, L-Arginosuccinato de L-Arg, ácidos grasos de cadena larga LCFA, malato de mal, ornitina de Orn, oxaloacetato de oxa, 3′-fosfoadenosina 5′-fosfosulfato de PAPS, polihidroxialcanoato de PHA, inorgánico de Pit transportador de fosfato, polifosfato Poli-P, transportador de fosfato Pst, ciclo rTCA, ciclo reductor del ácido tricarboxílico, proteína de choque térmico pequeña sHSP, superóxido dismutasa SOD, succinato de Suc, succinil-CoA de Suc-CoA.

En comparación con el comammox mesófilo Nitrospira, la pentahemo citocromo c nitrito reductasa (nrfAH) parece estar presente exclusivamente en los MAG del comammox de aguas termales (Fig. 2 y conjunto de datos complementarios 2) y en la N. inopinata moderadamente termófila [1]. Esto sugiere el potencial de los organismos comammox termófilos para realizar una reducción disimilatoria de nitrato a amonio (DNRA), utilizando el NXR potencialmente reversible para la reducción inicial de nitrato a nitrito. Este rasgo único de los genomas de comammox recuperados de ambientes de alta temperatura indica un posible papel de DNRA en su supervivencia, como se sugirió previamente para otras bacterias y arqueas termófilas [50, 51]. Específicamente, la capacidad de realizar DNRA proporciona un mecanismo alternativo para que comammox Nitrospira conserve energía en condiciones anóxicas, lo que potencialmente les permite sobrevivir también en ambientes anóxicos. Alternativamente, el uso de DNRA para producir amoníaco podría ser una estrategia para que el comammox Nitrospira de aguas termales sobreviva con nitrito como única fuente de nitrógeno [1] y, por lo tanto, en las condiciones limitadas de amonio observadas en las aguas termales. Sin embargo, incluso entonces, se necesitaría un donante de electrones de bajo potencial para la reducción de quinonas para iniciar el proceso DNRA y proporcionar electrones para los procesos biosintéticos, incluida la fijación de CO2. En estas prístinas aguas termales, los metabolitos orgánicos (liberados por otros organismos) o el H2 (un producto potencial de la reducción geoquímica del H2O a altas temperaturas y la fermentación de la biomasa en condiciones térmicas moderadas) podrían ser posibles donantes de electrones para el DNRA. Esto está respaldado por la presencia de genes metabólicos clave en los MAG de Nitrospira del comammox de aguas termales que están potencialmente asociados con estos procesos, es decir, fadD, crt y acd para el catabolismo de ácidos grasos de cadena larga, y la hidrogenasa del grupo 3b [NiFe] que podría facilitar la oxidación de H2 (Fig. 2 y conjunto de datos complementarios 2). En conjunto, estos resultados sugieren que el comammox Nitrospira de aguas termales tiene funciones ecológicas versátiles como sumideros y fuentes de amoníaco.

En ambientes de alta temperatura, las estrategias metabólicas que utilizan o producen H2 representan un enfoque esencial para la conservación de energía por parte de microorganismos quimiolitoautótrofos [23, 52]. Las hidrogenasas bidireccionales del grupo 3b [NiFe] y las proteínas accesorias para la maduración de la hidrogenasa, que ocurren ampliamente en NOB canónico y comammox Nitrospira [1, 53, 54], también se han observado en casi todos los comammox Nitrospira de aguas termales (Fig. 3a, b). . Como se observó en una arqueona hipertermófila (Pyrococcus furiosus) [55], las hidrogenasas del grupo 3b [NiFe] también podrían participar en el ciclo del azufre, que es otro elemento clave que se encuentra comúnmente en las aguas termales terrestres. A pesar de estos roles especulados, hasta el momento no se ha caracterizado la función auténtica de las hidrogenasas del grupo 3b [NiFe] en Nitrospira. Además, también observamos la presencia de complejos relacionados con la hidrogenasa (Ehr) convertidores de energía en siete MAG de Nitrospira comammox de aguas termales presentados aquí (Fig. 3c y Fig. Suplementaria S3), que son filogenéticamente cercanos al grupo 4 f [NiFe] hidrogenasas pero carecen de los motivos CxxC típicos necesarios para la unión del centro [NiFe]. Por lo tanto, es poco probable que estos complejos de Ehr actúen como hidrogenasas [NiFe] y su función sigue siendo desconocida. Sin embargo, es interesante observar su similitud con las subunidades del complejo respiratorio I y de las hidrogenasas convertidoras de energía (Ech), que participan en el transporte de electrones y la transducción de energía [56].

a El árbol de máxima probabilidad muestra la afiliación filogenética de hidrogenasas y complejos de Ehr identificados en comammox Nitrospira en relación con 305 secuencias de referencia. El árbol está codificado por colores según el subgrupo hidrogenasa. Las estrellas rojas representan hidrogenasas y complejos de Ehr del comammox Nitrospira de aguas termales. Los árboles de máxima probabilidad muestran la afiliación filogenética de las hidrogenasas b del grupo 3 [NiFe] y c del grupo 4 [NiFe] y los complejos de Ehr identificados en comammox Nitrospira y las hidrogenasas de referencia. Los valores de Bootstrap (basados en 1000 iteraciones) ≥ 70 y ≥ 90 se indican mediante círculos grises y negros, respectivamente.

La actividad in situ del comammox Nitrospira de aguas termales se confirmó mediante secuenciación metatranscriptómica (Fig. 4). Para evitar sesgos en la estimación de los niveles de expresión genética de MAG muy similares, seleccionamos manualmente siete de los 11 MAG de comammox de aguas termales como genomas de referencia en función de un AAI ≥ 95% y la calidad del genoma (Tabla complementaria S2). A partir de este análisis, se detectaron actividades transcripcionales de 976 de 19142 (5,1%) genes codificados en estos siete MAG, lo que sugiere que estos organismos tienen un papel activo en las tres muestras de aguas termales que se midieron.

La intensidad del color representa la abundancia relativa de la expresión genética medida por FPKM (sección de Métodos). Los cuadros blancos indican que la expresión genética es indetectable.

La vía de nitrificación se expresó al menos parcialmente en los siete MAG de referencia de comammox de aguas termales en los tres metatranscriptomas (Fig. 4). Por ejemplo, en JZ-2, JZ-4 y QQ, los MAG JZ-4_Bin17, QZM-B4_2_Bin429 y SRBZ-2_Bin320, respectivamente, expresaron todo el conjunto de genes relacionados con la nitrificación, incluidos amoCAB, hao y nxrAB. Además, la expresión de genes relacionados con la nitrificación representó la mayoría de las transcripciones asignadas a los MAG de Nitrospira comammox de aguas termales. La expresión de genes asociados con la nitrificación constituyó el 4,4% y el 4,0% de las transcripciones de comammox para SBRZ-2_Bin320 en la muestra QQ y JZ-4_Bin17 en la muestra JZ-2, respectivamente (Figura complementaria S4). Esto indica que la nitrificación fue un proceso clave catalizado por comammox Nitrospira en las aguas termales examinadas. Además, se observaron niveles bajos de expresión de otras vías del metabolismo del nitrógeno en al menos un comammox Nitrospira MAG de aguas termales. Estos genes incluían nitrito reductasa formadora de NO (nirK), nitrito reductasa pentahemo citocromo c (nrfA) y transportadores de urea (urtABC). Esto sugiere que el comammox Nitrospira de aguas termales puede estar involucrado en procesos adicionales de ciclado del nitrógeno, como la reducción de nitrito a óxido nítrico, DNRA y utilización de urea.

Además, la expresión de la vía de nitrificación completa no se observó de manera consistente para todos los MAG de comammox. Por ejemplo, DGJ02_3_Bin65 expresó nxrAB en las tres muestras, mientras que no se detectaron transcripciones de hao o amoCAB, y amoC parecía ser el único gen transcrito relacionado con la nitrificación por QZM_B4_3_Bin89. Esta falta de expresión del gen de nitrificación por parte de algunas cepas de comammox podría reflejar una actividad metabólica limitada de estos organismos en condiciones extremas en aguas termales. De manera similar a nuestras observaciones, la expresión parcial de genes relacionados con la nitrificación en comammox Nitrospira también se observó en un estudio anterior [57], donde las transcripciones de amoCAB y nxrAB se detectaron de manera inconsistente en diferentes especies de comammox.

La transcripción de genes asociados con la adaptación térmica también confirmó la actividad del comammox de aguas termales Nitrospira y arrojó luz sobre sus posibles mecanismos de supervivencia. Las proteínas de choque térmico (HSP) son expresadas por las células en respuesta al estrés externo. Contribuyen a la eliminación y replegamiento de proteínas dañadas, al ensamblaje de proteínas, a la secreción y a la regulación de factores de transcripción, y también pueden desempeñar un papel protector para otras proteínas al formar complejos dependientes de la temperatura [58]. Como se esperaba, los siete MAG Nitrospira comammox de aguas termales seleccionados codificaron y transcribieron una variedad de acompañantes (Fig. 4 y conjunto de datos complementarios 2). Por ejemplo, el gen de la proteína chaperona altamente conservada DnaK, que funciona en el plegamiento de proteínas y previene la agregación de proteínas que se despliegan bajo estrés [59], fue expresado por casi todos los MAG de Nitrospira de comammox de aguas termales. Se detectaron varias copias de HSP pequeñas (HSP20) en SRBZ2-Bin320 y exhibieron altos niveles de expresión en el conjunto de datos metatranscriptómicos de la muestra QQ (Figura complementaria S4). Las chaperoninas de las familias GroEL-GroES y proteasa caseinolítica (Clp) también fueron altamente transcritas por el comammox Nitrospira de aguas termales. Las chaperoninas GroEL-GroES pueden encapsular y plegar proteínas, mientras que los miembros de la familia Clp pueden regular la desagregación y degradación de proteínas distorsionadas y también pueden orquestar DnaK para replegar proteínas mal plegadas [60]. Además, el factor de intercambio de nucleótidos (GrpE), los genes del locus de choque térmico dependientes de ATP (HslVU) y varios genes asociados con la defensa contra el estrés oxidativo se expresaron altamente, lo que indica que comammox Nitrospira adopta diversos mecanismos de mitigación del estrés térmico.

Ajustar la composición de aminoácidos de las proteínas es una importante estrategia de adaptación de los microorganismos para superar el estrés térmico [61, 62]. De acuerdo con esta hipótesis, la comparación de las composiciones de aminoácidos de 30 MAG de comammox Nitrospira del clado A (Texto complementario S1) reveló que comammox Nitrospira recuperado de hábitats térmicos y no térmicos ha desarrollado distintos patrones de uso de aminoácidos (Figura complementaria S5). Específicamente, el comammox Nitrospira termofílico utiliza más aminoácidos cargados y no polares a expensas de los aminoácidos polares (p <0,01). Este fenómeno puede atribuirse a las características químicas de diferentes aminoácidos: los enlaces iónicos fuertes entre residuos de aminoácidos con cargas opuestas aumentan la estabilidad de una proteína, mientras que los aminoácidos polares (p. ej., Asn y Gln) generalmente resultan en una disminución de la estabilidad de la proteína debido a a la desamidación térmica [63, 64]. El patrón de uso de aminoácidos específico por parte del comammox Nitrospira termófilo está en línea con una comparación previa entre la composición de aminoácidos de 60 proteínas termófilas y sus homólogos mesófilos [65], así como observaciones generales sobre la composición de proteínas en otros termófilos [64, 66]. . Estos resultados sugieren fuertemente que los fenotipos termófilos de comammox Nitrospira pueden identificarse en función de su composición de aminoácidos prevista y deducida de materiales genómicos. En consecuencia, probamos además un índice típico basado en la composición de aminoácidos, el índice IVYWREL [67], para distinguir el comamox Nitrospira termófilo de los miembros no termófilos. Como se esperaba, el índice IVYWREL fue significativamente diferente (p <0,01) para el comammox Nitrospira termófilo y mesófilo (Figura complementaria S6), lo que proporciona evidencia adicional de diferencias de composición basadas en sus perfiles de uso de aminoácidos. Cabe destacar que el índice IVYWREL de Nitrospira sp. ST-BIN4, Nitrospira sp. SG-bin2, Nitrospira sp. UBA2082 y Nitrospira sp. Se determinó que UBA6909, que se obtuvo de hábitats no térmicos pero que son filogenéticamente cercanos al comammox térmico Nitrospira (Fig. 1), es de 40,0 ~ 40,3 y, por lo tanto, también significativamente más bajo que el del comammox térmico Nitrospira (p <0,01). Esto brinda un fuerte apoyo a la hipótesis de que los perfiles únicos de aminoácidos observados se deben genuinamente al fenotipo termófilo más que a una afiliación filogenética.

Además de los cambios en la utilización de aminoácidos, también comparamos las propiedades genómicas de 30 MAG de Nitrospira comammox del clado A (Texto complementario S1) y observamos varias diferencias notables entre el clado A comammox Nitrospira térmico y no térmico que pueden arrojar luz sobre una posible adaptación. Estrategias en ambientes de alta temperatura. Específicamente, los MAG termofílicos comammox Nitrospira tienen un tamaño de genoma significativamente más pequeño (2.46–3.30 Mbp) que el clado mesófilo A comammox Nitrospira (2.93–4.55 Mbp; p <0.05) (Fig. 5a). Esto no es sorprendente, ya que se considera que la reducción del tamaño del genoma es beneficiosa para la tolerancia microbiana al calor a través de la reducción de los requisitos de energía para la síntesis de nucleótidos [68]. Por ejemplo, Sabath et al. [68] compararon más de 1000 genomas de procariotas y observaron diferencias significativas en el tamaño del genoma entre mesófilos, termófilos e hipertermófilos, y Sorensen et al. [69] informaron una correlación significativa y negativa entre el tamaño promedio del genoma y la temperatura del sitio en 12 metagenomas obtenidos de suelos afectados por incendios. En consecuencia, aquí se observó una fuerte correlación entre el tamaño del genoma y la temperatura de crecimiento óptima prevista (OGT, ver detalles en el Texto complementario S1) para los genomas de Nitrospira comammox del clado 30 (Figura complementaria S7).

El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. un tamaño del genoma; b contenido de GC; c temperatura óptima de crecimiento prevista (OGT); d recuento de genes; e longitud media del gen; f densidad de codificación.

Otra característica genómica importante es el contenido de GC. Con resultados contradictorios observados en diferentes estudios [67, 70, 71], la correlación entre el contenido de GC y la tolerancia microbiana contra el estrés por calor aún es difícil de alcanzar. Aquí, encontramos que el contenido de GC fue significativamente mayor en los MAG termofílicos de Nitrospira comammox que en los comammox Nitrospira de clado A no térmico (55, 48–59, 31% frente a 54, 67–57, 89%; p <0, 05) (Fig. 5b). Como se esperaba, también se encontró que la OGT era significativamente mayor para los genomas derivados de hábitats térmicos (Fig. 5c, p <0,05). Además, la disminución observada en el recuento de genes, el aumento de la longitud promedio de los genes y el aumento de la densidad de codificación (Fig. 5d-f) indican que las proteínas prescindibles y de baja estabilidad podrían haberse perdido preferentemente de los genomas de estos comammox termófilos Nitrospira [72]. Además, el comammox Nitrospira termófilo generalmente posee menos genes que codifican transportadores y sistemas de secreción bacteriana en comparación con el comammox Nitrospira del clado A no térmico (Figura complementaria S8). Esta observación está de acuerdo con la hipótesis de que la reducción de la complejidad funcional es probablemente un mecanismo que minimiza los costos y ahorra energía para que los termófilos se adapten a temperaturas elevadas [73]. En conjunto, las características genómicas observadas del comammox termófilo Nitrospira indican que estos organismos están bien adaptados para sobrevivir en ecosistemas de alta temperatura.

El descubrimiento y la caracterización de comammox Nitrospira cambiaron significativamente nuestra comprensión del ciclo del nitrógeno mediado por microbios, ya que anuló un siglo de conocimiento acumulado al demostrar que la nitrificación completa puede ser llevada a cabo por un solo microorganismo en lugar de múltiples microorganismos en conjunto. Aquí, informamos la detección de comammox Nitrospira en ambientes de aguas termales a temperaturas de hasta 80 °C y sus actividades transcripcionales a temperaturas de hasta 70 °C. Si bien se han realizado numerosos esfuerzos para mostrar la existencia ubicua de comammox Nitrospira en diferentes entornos ambientales [12, 13, 53], el presente estudio agrega un elemento clave a la investigación sobre el ciclo biogeoquímico del nitrógeno en ambientes de alta temperatura.

En comparación con los suelos y sistemas acuáticos afectados por el hombre (por ejemplo, contaminados, fertilizados o modificados), las concentraciones de amonio en las fuentes termales examinadas eran mucho más bajas. En teoría, esto podría explicar el dominio de comammox Nitrospira sobre los otros gremios que oxidan amoníaco en ocho de cada diez muestras porque probablemente estén bien adaptados a condiciones limitadas de nitrógeno [4, 5]. Además, la comparación de las propiedades genómicas mostró tamaños de genoma relativamente más pequeños de las bacterias comammox de aguas termales, lo que generalmente refleja un tamaño celular más pequeño [74, 75] y tiende a ser ventajoso para optimizar la relación superficie-volumen para la absorción óptima de baja densidad. -abundancia de nutrientes [76,77,78]. Sin embargo, la disponibilidad limitada de amoníaco puede no ser el único factor que favorece su aparición, ya que se encontró que comammox Nitrospira domina sobre otros oxidantes de amoníaco en muchos sistemas de suelo donde la concentración de amonio variaba de 0,1 a 20 mg kg-1 de suelo [79,80,81 ,82]. Es probable que otros factores ambientales como el pH, el nivel de oxígeno, la temperatura y la salinidad también contribuyan a la diferenciación de nicho entre los oxidantes de amoníaco [79, 81], y sus respuestas diferenciales a estos factores a menudo se utilizan para explicar su coexistencia o para comparar. Competitividad entre especies de diferentes gremios oxidantes de amoníaco. La temperatura y el pH influyen directamente en la cinética de los oxidantes de amoníaco [78, 83, 84], y un estudio reciente demostró que las constantes de afinidad del amoníaco de N. inopinata y el AOA 'Candidatus Nitrosocosmicus oleophilus MY3' aumentaron de 3 a 4 veces cuando el pH era elevado de ~6,5 a ~8,5 [78].

También buscamos las secuencias del gen 16S rRNA y amoA recuperadas de SRBZ-2_Bin320 en la base de datos pública y encontramos secuencias muy similares en otros hábitats térmicos en Rusia, India, Argentina y Australia (Texto complementario S2 y Conjunto de datos 3), lo que sugiere una variedad potencialmente amplia. Distribución de comammox Nitrospira en hábitats térmicos. Cabe señalar que estas cepas detectadas identificadas en base a secuencias cortas son solo bacterias comammox potenciales. Se requieren estudios futuros, incluidos esfuerzos de cultivo en combinación con análisis metagenómicos, metatranscriptómicos y metaproteómicos, para confirmar su papel en la oxidación del amoníaco en estos sistemas.

En conjunto, este estudio confirma la distribución frecuente y la actividad transcripcional de comammox Nitrospira en ecosistemas de alta temperatura y destaca sus contribuciones a las conversiones de nitrógeno allí. Al comparar las bacterias comammox térmicas y no térmicas, los resultados proporcionan información sobre las posibles estrategias de adaptación que las bacterias comammox de aguas termales utilizan contra el estrés por calor, incluidos perfiles de uso de aminoácidos adaptados, características genómicas modificadas y la expresión de una gran cantidad de HSP. Este estudio también es de particular importancia ya que las aguas termales terrestres representan un nicho importante que sustenta una variedad de extremófilos quimiolitoautótrofos, y comprender las conversiones microbianas de nitrógeno allí es muy relevante desde el punto de vista ecológico [19,20,21]. Si bien las contribuciones de AOB y AOA al ciclo del nitrógeno en aguas termales se han documentado previamente [24,25,26,27, 29, 85], los hallazgos actuales llenan un importante vacío de conocimiento al proporcionar evidencia de la aparición y actividades de las bacterias comammox. en las aguas termales examinadas.

Si bien la evidencia transcriptómica in situ presentada aquí confirma por primera vez la actividad de comammox Nitrospira en aguas termales, se necesitarán investigaciones de seguimiento para validar aún más los resultados. Una vez que estén disponibles cultivos de enriquecimiento de estos organismos comammox, los experimentos fisiológicos específicos pueden proporcionar evidencia más directa de sus actividades, adaptaciones térmicas y otras características ecofisiológicas. Actualmente, en la mayoría de las fuentes termales que analizamos, faltan datos ambientales, por ejemplo, las concentraciones de H2, compuestos orgánicos, urea y oxígeno disuelto. Esta información será necesaria para comprender mejor cómo los nitrificantes termófilos, incluidas las bacterias comammox, se enfrentan a condiciones extremas y regulan su metabolismo en un entorno variable.

Los contenedores de genoma utilizados en este estudio se depositaron en el NCBI en el marco del proyecto PRJNA851927.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (52100174, 32170014, 91951205), la Fundación de Investigación Básica y Aplicada de Guangdong (2019A1515111024) y el Proyecto de Descubrimiento del Consejo Australiano de Investigación (ARC) (DP230101340). TL recibió una beca ARC DECRA (DE220101310). PE recibió una beca ARC Future (FT210100812). SL cuenta con el apoyo de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (subvención 016.Vidi.189.050), HD del Fondo Austriaco para la Ciencia (FWF; subvención P30570-B29) y de la Plataforma de Investigación Comammox de la Universidad de Viena.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por CAUL y sus Instituciones Miembro.

Estos autores contribuyeron igualmente: Yan Zhang, Tao Liu y Meng-Meng Li.

Escuela de Ingeniería Química y Ambiental, Universidad de Foshan, Foshan, China

Yan Zhang

Centro Australiano de Biotecnología Ambiental y del Agua, Facultad de Ingeniería, Arquitectura y Tecnología de la Información, Universidad de Queensland, Santa Lucía, QLD, Australia

Tao Liu, Min Zheng y Jianhua Guo

Laboratorio Estatal Clave de Biocontrol, Laboratorio Provincial Clave de Recursos Vegetales y Ciencia e Ingeniería Marinas del Sur Laboratorio de Guangdong (Zhuhai), Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, China

Meng-Meng Li, Yanni Qu, Sha Tan, Jian-Yu Jiao y Wen-Jun Li

Departamento de Ingeniería y Ciencias Ambientales, Universidad de Ciencia y Tecnología de China, Hefei, China

Zheng Shuang Hua

Centro Australiano de Ecogenómica, Facultad de Química y Biociencias Moleculares, Universidad de Queensland, Santa Lucía, QLD, Australia

Pablo Evans

Escuela de Ingeniería y Ciencias Ambientales, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510275, China

Hui Lu

Departamento de Microbiología, RIBES, Universidad de Radboud, Heyendaalseweg 135, 6525 AJ, Nijmegen, Países Bajos

Sebastián Lucker

División de Ecología Microbiana, Centro de Microbiología y Ciencia de Sistemas Ambientales, Universidad de Viena, Djerassiplatz 1, 1030, Viena, Austria

Holger Daims

Plataforma de investigación Comammox, Universidad de Viena, Djerassiplatz 1, 1030, Viena, Austria

Holger Daims

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JG, WL y ZH concibieron el estudio. YZ, ZH, ML y TL realizaron el metagenoma, el metatranscriptoma y el análisis de datos, con el apoyo de YQ, ST, HL, JJ, SL y HDTL e YZ escribieron el manuscrito con el aporte de todos los autores. PE, SL, HD y MZ apoyaron la revisión del manuscrito.

Correspondencia a Zheng-Shuang Hua, Wen-Jun Li o Jianhua Guo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Zhang, Y., Liu, T., Li, MM. et al. Distribución de aguas termales y mecanismos de supervivencia del comammox termófilo Nitrospira. ISME J 17, 993–1003 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01409-w

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Recibido: 03 de agosto de 2022

Revisado: 29 de marzo de 2023

Aceptado: 31 de marzo de 2023

Publicado: 17 de abril de 2023

Fecha de emisión: julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01409-w

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